【摘 要】
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[目的]通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TGGA）数据比较PAQR4在人的头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSC）中同正常组织细胞中的相对表达情况差异,并以此为基础,研究PAQR4在鼻咽癌细胞和正常永生化鼻咽上皮细胞中的相对表达差异,发现PAQR4在鼻咽癌细胞中的mRNA水平上呈显著高表达。提示
【基金项目】
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云南省“万人计划”-名医人才专项培养项目（YNWR-MY-2019-069）；
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[目的]通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TGGA）数据比较PAQR4在人的头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSC）中同正常组织细胞中的相对表达情况差异,并以此为基础,研究PAQR4在鼻咽癌细胞和正常永生化鼻咽上皮细胞中的相对表达差异,发现PAQR4在鼻咽癌细胞中的mRNA水平上呈显著高表达。提示PAQR4可能与鼻咽癌的发生发展密切相关。本课题拟通过建立稳定的PAQR4低水平表达细胞系,验证PAQR4在鼻咽癌细胞对增殖、迁移、侵袭和细胞周期的影响,研究PAQR4在鼻咽癌发生发展中的作用及其机制。[方法]1.首先通过分析癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas,TGGA）数据,选取520例HNSC患者样本和44例正常样本,分析PAQR4在HNSC与正常组织细胞中的mRNA相对表达量差异和肿瘤的相关性。2.利用QRT-PCR的方法,研究PAQR4在鼻咽癌细胞（CNE-1、CNE-2、6-10B、5-8F、SUNE-1）和正常对照的人永生化正常鼻咽上皮细胞NP69的mRNA水平,比较鼻咽癌细胞中PAQR4的表达水平是否异常,与生物信息学方法研究结果是否一致。3.通过构建三条PAQR4低表达载体shRNA和对照组载体Scramble shRNA,通过HEK-293T细胞转染后,收集慢病毒感染野生型鼻咽癌细胞系SUNE-1和CNE-2,建立PAQR4基因的稳定低表达细胞系,同时利用QRT-PCR的方法来鉴定检测其敲低效率4.使用建立好的PAQR4基因低表达的稳转细胞系,通过肿瘤生长曲线、克隆球形成实验来检验PAQR4对鼻咽癌细胞增殖的影响;用细胞划痕实验来检验PAQR4对鼻咽癌细胞迁移能力的影响,以及通过肿瘤侵袭实验的方法验证PAQR4对鼻咽癌细胞侵袭能力的影响;通过流式细胞术检测PAQR4对鼻咽癌细胞周期的影响,western blot检测相关周期蛋白表达水平,同时解析PAQR4调控鼻咽癌发生发展的机制。[结果]1.数据分析发现PAQR4在多种实体瘤中均显著的高表达,在HNSC中mRNA表达量明显高于正常的组织样本,且在HNSC男性患者较女性高表达,表达情况同肿瘤病理分级和淋巴转移情况呈正相关（P＜0.001）。2.从人体正常永生化鼻咽上皮细胞NP69和鼻咽癌细胞（CNE-1、CNE-2、6-10B、5-8F、SUNE-1）中提取mRNA,通过QRT-PCR证实了 PAQR4在鼻咽癌细胞中mRNA水平呈高表达,与生物信息学结果一致。3.通过构建PAQR4低表达质粒和对照质粒,建立PAQR4的稳定低表达细胞系,从相对mRNA水平来检测和鉴定敲低效率,结果敲低效率良好。4.使用已建立的PAQR4的稳定低表达细胞系,通过肿瘤细胞生长曲线实验和克隆球形成实验,结果显示敲低PAQR4的表达后,鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2的细胞增殖能力和克隆球形成能力均被抑制;细胞划痕实验结果显示,敲低PAQR4后,鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2的创口愈合能力被抑制;肿瘤侵袭实验结果显示,敲低PAQR4后,鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2穿透基质胶的能力被抑制。通过流式细胞术检测,实验结果显示敲低PAQR4后,鼻咽癌细胞SUNE-1、CNE-2的细胞周期被阻滞在G0/G1期,western blot实验结果显示CDK2、CDK6蛋白水平无明显变化,CDK4蛋白的表达水平下调,并且通过检测AKT和p-AKT的表达情况,结果显示磷酸化AKT的蛋白表达水平被下调,而总的AKT蛋白表达量不变。[结论]1.PAQR4在HNSC组织中呈显著高表达,并且在HNSC男性患者较女性患者高,其表达水平同肿瘤病理分级和淋巴转移情况呈正相关（P＜0.001）。2.PAQR4在鼻咽癌细胞中呈显著高表达,敲低PAQR4后鼻咽癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均被抑制,同时鼻咽癌细胞的CDK4的蛋白表达水平被下调,细胞周期被阻滞在G0/G1期。3.PAQR4可能是通过激活PI3K/AKT信号通路来调控CDK4的蛋白表达水平,进而影响了鼻咽癌细胞的发生发展过程,未来可能成为鼻咽癌新的诊疗靶点。
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