两株腐霉菌次生代谢产物的研究

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腐霉菌(Pythium)是一类分布范围广、适应能力强的卵菌纲(Oomycetes)真菌。大多数腐霉菌是植物的病原真菌,其寄主范围十分广泛,可以对葫芦科、豆科、百合科以及禾本科等植物产生不同程度的危害,损害植物的根、茎、叶等部位,引起植株苗期猝倒、苗腐、根腐、茎腐以及果实和种子的腐烂等症状。腐霉菌可以分泌二十碳五烯酸(EPA)、叶酸、抗坏血酸、生长激素等对人或植物有益的次生代谢产物;也可以分泌邻苯二甲酸酯、4-羟基-3-甲氧基肉桂酸等一系列对人或植物有害的次生代谢产物。目前对于腐霉菌次生代谢产物的研究报道较少,为了探索腐霉菌是否会产生真菌毒素以及会产生哪些对人或植物有害的次生代谢产物,我们对两株分离自生姜和番茄的致病腐霉菌的次生代谢产物进行了研究。以大米培养基为发酵培养基对其进行大规模发酵,乙酸乙酯提取次生代谢产物,运用天然产物分离技术对其粗提物进行分离纯化,共获得了18个单体化合物,通过核磁共振(NMR)、质谱(MS)以及文献比对等方法对其进行了鉴定。具体内容如下:1.采集了山东省潍坊市安丘市的生姜病样和山东省青岛市胶州市的番茄病样,对采集的样本进行分离、纯化,获得了两株病原真菌SJ-1和FQ-1。通过观察其菌落形态和显微形态特征,并结合ITS基因测序的方法鉴定了这两株腐霉菌分别为:林栖腐霉(Pythium sylvaticum)和终极腐霉(Pythium ultimum)。2.以大米培养基为发酵培养基对这两株腐霉菌进行大规模发酵,使用乙酸乙酯浸泡提取其次生代谢产物,通过旋转蒸发仪真空浓缩后获得林栖腐霉(P.sylvaticum)粗提物20 g,终极腐霉(P.ultimum)粗提物12.5 g。3.采用终极腐霉(P.ultimum)粗提物对番茄幼苗进行致病性检测,发现终极腐霉(P.ultimum)粗提物对番茄幼苗有致根腐和茎腐的作用,并会引起番茄幼苗猝倒。通过液相色谱-质谱联用技术(HPLC-MS)对终极腐霉(P.ultimum)粗提物样本进行检测,并与数据库进行对比,结果未发现终极腐霉(P.ultimum)粗提物中有常见真菌毒素的存在。4.分别将林栖腐霉(P.sylvaticum)和终极腐霉(P.ultimum)的粗提物进行分离,先经由硅胶柱层析分离,然后薄层层析检测合并相似组分,随后将合并的组分经由Sephadex LH-20分离,然后使用高效液相色谱进行分离纯化,共获得化合物18个。随后通过核磁共振波谱(NMR)、质谱(MS)和文献比对等方式鉴定出了其中的14个化合物。鉴定结果如下:林栖腐霉(P.sylvaticum)分离鉴定出的8个化合物分别为:thymidine,indole-3-ethanol、(R)-3-hydroxy-3-(2-hydroxyethyl)indolin-2-one、stigmasterol、β-sitosterol、tyrosol、phenylacetic acid和dibutyl phthalate。终极腐霉(P.ultimum)分离获得10个化合物,已鉴定出的6个化合物分别为:phenazine-1-carboxylic acid、aerugine、aeruginol、13-methyltetradecanoic acid、phenazine-1-carboxamide和linoleic acid。从林栖腐霉(P.sylvaticum)中获得的8个化合物均为首次从该菌中分离获得,发现两种对人体有害的化合物dibutyl phthalate和phenylacetic acid。从终极腐霉(P.ultimum)中分离获得10种化合物,其中phenazine-1-carboxylic acid和phenazine-1-carboxamide为两种广谱抗菌素,拓展了抗菌素的来源。
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