【摘 要】
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目的:本研究旨在构建小分子多肽精氨酸-甘氮酸-天冬氨酸序列（RGD）修饰的抑癌分子circ DIDO1工程化外泌体（RGD-Exo-circ DIDO1）,揭示其在胃癌进展中的作用和体内应用安全性,阐明其发挥抑癌作用的分子机制,为circ RNA靶向治疗胃癌提供新的依据和策略。方法:1.应用过表达circ DIDO1质粒转染293T细胞的方法获取过表达circ DIDO1的外泌体（Exo-circ
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目的:本研究旨在构建小分子多肽精氨酸-甘氮酸-天冬氨酸序列（RGD）修饰的抑癌分子circ DIDO1工程化外泌体（RGD-Exo-circ DIDO1）,揭示其在胃癌进展中的作用和体内应用安全性,阐明其发挥抑癌作用的分子机制,为circ RNA靶向治疗胃癌提供新的依据和策略。方法:1.应用过表达circ DIDO1质粒转染293T细胞的方法获取过表达circ DIDO1的外泌体（Exo-circ DIDO1）,以空载体质粒（Vector）转染293T细胞后获取外泌体（Exo-Vector）作为对照,应用超速离心法提取外泌体后,将纯化的外泌体与DSPE-PEG-RGD共孵育,获得RGD-Exo-Vector和RGD-Exo-circ DIDO1。应用纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis,NTA）、蛋白质印迹法（Western blot）和透射电子显微镜（transmission electron microscope,TEM）外泌体表征等技术鉴定其粒径、形态及表面特异性标志物。2.采用共聚焦显微镜观察RGD-Exo-circ DIDO1对胃癌细胞的靶向能力,应用q RT-PCR（real-time quantitative reverse transcription,PCR）检测胞内circ DIDO1的含量改变。采用生长曲线和平板克隆实验检测RGD-Exo-circ DIDO1处理后胃癌细胞株（MGC-803、HCG-27）的增殖能力,应用Transwell迁移实验和基质胶侵袭实验验证RGD-Exo-circ DIDO1处理后胃癌细胞迁移和侵袭能力的变化,应用流式细胞术检测RGD-Exo-circ DIDO1处理后胃癌细胞凋亡比率。3.体内构建MGC-803皮下荷瘤小鼠模型,以PBS和RGD-EX-Vector为对照,观察RGD-Exo-circ DIDO1对肿瘤生长的抑制效果。通过分析肿瘤大小和肿瘤组织切片H＆E染色、免疫组化染色、TUNEL染色以评价RGD-Exo-circ DIDO1对肿瘤生长的影响。摘取小鼠的主要脏器进行H＆E染色并收集血液进行生化分析以评价RGD-Exo-circ DIDO1的体内应用安全性。4.结合已知的RNA测序分析结果和生信分析技术,筛选出mi R-1307-3p调控胃癌发展的关键下游靶基因,利用荧光素酶活性检测实验、回补实验和功能学实验等分析circ DIDO1及mi R-1307-3p对筛选出的关键靶基因的调控作用。应用Western blot、q RT-PCR等技术分析RGD-Exo-circ DIDO1处理后胃癌细胞和组织中mi R-1307-3p和下游靶基因的变化情况。结果:1.成功构建了RGD修饰的装载circ DIDO1的工程化外泌体（RGD-Exocirc DIDO1）,透射电镜观察可见典型的盘状磷脂双层膜结构,Nanosight粒径分析结果显示外泌体的平均大小约为120 nm,Western blot实验结果显示构建的外泌体均表达特异性标志蛋白CD9、CD63和TSG101,不表达calnexin。2.共聚焦显微镜结果显示,RGD修饰的外泌体具有更好的胃癌细胞靶向性。相比于对照组,RGD-Exo-circ DIDO1处理后两种胃癌细胞（MGC-803、HGC-27）中circ DIDO1的含量明显升高。功能学实验结果显示,RGD-Exo-circ DIDO1能明显抑制胃癌细胞的增殖、迁移与侵袭,促进其凋亡。3.裸鼠皮下瘤模型治疗实验结果显示,RGD-Exo-circ DIDO1治疗后皮下瘤体积减小,重量减轻。H＆E染色、Ki67免疫组化染色和TUNEL染色结果表明RGD-Exo-circ DIDO1治疗可抑制裸鼠皮下瘤的生长。小鼠主要脏器H＆E染色和血液生化分析结果提示RGD-Exo circ DIDO1具有较好的生物安全性。4.结合RNA测序分析结果和生信分析技术进行筛选,得出mi R-1307-3p可与SOCS2结合。荧光素酶报告基因实验、回补实验和相关功能学实验证明circ DIDO1通过mi R-1307-3p的ce RNA机制负向调控SOCS2的表达水平。q RT-PCR和Western blot结果显示,RGD-Exo-circ DIDO1处理后的胃癌细胞和组织中mi R-1307-3p表达水平下降,而SOCS2的表达水平升高。结论:成功构建了以外泌体为载体的抑癌分子（circ DIDO1）递送系统即RGD-Exo-circ DIDO1,不仅能在体内外抑制肿瘤进展,且具有较高的生物安全性。阐明了RGD-Exo-circ DIDO1通过mi R-1307-3p/SOCS2轴发挥抑制胃癌作用的新机制。为以外泌体为载体来递送circ RNA的抗肿瘤治疗提供了新的方法和策略。
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