三叶青藤醇提物对人滑膜肉瘤细胞(SW982)TLR8及其信号通路调节作用研究

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目的:三叶青藤Illigera rhodantha Hance.(SYQT)是一种广西民间具有镇痛抗炎作用的药物,TLR8及其信号通路在类风湿关节炎(RA)的发病机制中发挥重要作用,因此本课题拟采用网络药理学的方法,结合体外基于SW982细胞对TLR8通路及下游炎症因子调节的实验结果,探讨SYQT醇提物可能的抗炎活性成分及作用机制,为后续深入研究RA提供线索,以增强其临床使用的合理性和准确性。方法:1、SYQT药物提取及成分分析:分别以首次SYQT 10倍量和二次SYQT 8倍量的95%乙醇提取1.5 h,合并两次乙醇提取所得滤液,进行旋转蒸发浓缩,再将浓缩好的滤液进行水浴加热成膏状;通过高效液相色谱和质谱联用技术(LC-MS)初步对SYQT醇提物的化学成分进行分析。2、根据网络药理学进行分析,利用Swiss Target Prediction数据库检索SYQT醇提物化学成分的潜在靶点;利用DisGeNET数据库检索RA相关基因靶点;利用STRING数据库进行SYQT和RA蛋白互作网络分析;利用David数据库对SYQT和RA共有的基因靶点进行GO生物学过程富集和KEGG信号通路富集分析,获得SYQT治疗RA作用相关的生物学过程和信号通路,并采用Cytoscape 3.7.1对SYQT“活性成分-基因靶点-生物学过程/信号通路”网络进行可视化处理。3、通过CCK-8法检测LPS、R848、SYQT醇提物含药血清、青藤碱、Cu-CPT-8m对SW982细胞增殖能力的影响,以及通过RT-qPCR检测不同浓度及不同作用时间的LPS、R848对SW982细胞TLR8及其信号通路、下游炎症因子表达的影响,筛选出最佳药物浓度范围及作用时间;通过RT-qPCR、Western Blot及ELISA检测SYQT醇提物含药血清、青藤碱、Cu-CPT-8m对SW982细胞TLR8及其信号通路下游分子表达的影响。结果:1、根据文献的查阅和LC-MS检测结果的分析,目前得到了SYQT醇提物9个化合物,分别是赤式-紫丁香酰甘油、黑风藤苷A、黑风藤苷、阿江榄仁树葡糖苷Ⅱ、β-谷甾醇、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯及木脂素苷。2、通过网络药理学的研究,SYQT醇提物的主要化学成分涉及390个基因靶点,RA疾病靶点有1832个,SYQT醇提物化学成分—RA共同靶点146个,作用到RA主要有6个生物学过程,可能通过影响Toll样受体信号通路、PI3K-Akt信号通路等多个信号通路起到抗RA的作用。3、CCK-8法及RT-qPCR法检测结果表明,2μg/mL R848、10 ng/mL LPS干预SW982细胞48 h后,对SW982细胞的增殖能力影响较小,且上调SW982细胞TLR8信号通路及下游炎症因子mRNA的表达,与正常组相比差异有统计学意义(P<0.05);RT-qPCR、Western Blot和ELISA检测结果表明,不同浓度的SYQT醇提物含药血清(5%、10%、20%)、青藤碱、Cu-CPT-8m分别干预SW982细胞48 h后,TLR8信号通路及下游炎症因子的表达水平显著降低(P<0.05)。结论:1、通过文献查阅和LC-MS检测,得到了SYQT醇提物的9个化学成分,分别是赤式-紫丁香酰甘油、黑风藤苷A、黑风藤苷、阿江榄仁树葡糖苷Ⅱ、β-谷甾醇、没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯及木脂素苷。2、通过网络药理学的研究,分析得出SYQT醇提物对多种细胞信号通路有调节作用,揭示SYQT具有“多成分-多靶点”的抗RA作用特征,也为后续SYQT抗RA的机制研究及临床联合应用提供一定参考。3、通过SW982细胞验证,SYQT醇提物含药血清可以抑制TLR8的表达,下调My D88蛋白及炎症因子的表达,初步阐明了SYQT醇提物含药血清通过对SW982细胞TLR8及其信号通路的调节作用发挥其抗RA作用。4、综合以上结果,推测SYQT醇提物含药血清对SW982细胞TLR8信号通路具有调节作用,可以抑制TLR8的表达及下游炎症因子的表达,这为后续深入研究SYQT治疗RA提供线索,以增强其临床使用的合理性和准确性。
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