造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSCs)是目前研究最为深入的成体干细胞,其具有向髓系、淋巴系、巨核系祖细胞的多向分化的功能,是极富应用前景的研究领域,很可能给人类带来革命性的变化。然而,造血干细胞研究尚存在许多亟待解决的困惑,比如,造血干细胞特异性分子标志、多向分化潜能分子机制、造血干细胞在未分化状态下长期增殖的关键因子、造血干细胞受损相关疾病(白血病、再生障碍性贫血、骨髓增生异常综合征)发生机制等,既是造血干细胞研究的热点,也是造血干细胞研究的难点。近年来,一类叫做microRNAs(miRNAs)的非编码小RNA分子,在监控个体发育时相转变、调控特定细胞增殖、分化进程等方面起着重要作用,其在维持干细胞定向分化和自我更新功能维持中的作用,逐渐被科学家们发现,目前已经掀起miRNAs在干细胞研究中的热潮。HSCs中miRNAs表达状况尚未见报道,miRNAs在HSCs发育中的作用尚知之甚少。建立高通量筛选miRNAs的技术平台,获得并鉴定造血干细胞发育相关的miRNAs,是研究造血干细胞相关miRNAs的起点。因此,本课题拟研制新型哺乳动物miRNAs检测基因芯片,筛选造血干细胞发育相关miRNAs,生物信息学分析及验证其作用靶点,并探讨其在促进造血干细胞发育中的作用,研究结果为探明miRNAs调控造血干细胞发育的分子机制、探索诱导造血干细胞定向分化的新手段提供理论指导和实验依据。研究目的1、研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片。2、通过miRNAs芯片杂交,获取CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱。3、生物信息学分析预测并验证miRNAs作用靶点。4、探索miRNAs在造血干细胞发育中的作用。研究内容和方法1、研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片以已知哺乳动物基因组miRNAs序列为依据,合成相应DNA探针,制作新型哺乳动物miRNAs检测基因芯片。2、CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱的筛选流式细胞仪细胞分选人脐血CD34+CD38-造血干细胞及CD34+造血祖细胞,提取其总RNA,分离纯化18-100nt小片段RNA,经扩增及荧光标记后,与基因芯片进行分子杂交,获得CD34+CD38-造血干细胞miRNAs表达谱。3、实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)对miRNAs芯片结果的验证选取6个在CD34+CD38-造血干细胞中差异表达的miRNAs,以Q-RT-PCR加以验证,对miRNAs芯片结果进行初步验证,对结果一致的miRNAs行3次重复实验以确证Q-RT-PCR结果的可靠性。4、生物信息学分析及miRNAs作用靶点的验证生物信息学分析miR-129、miR-526b*和miR-520h的染色体定位、保守性分析等,利用网络共享软件picTar、miRanda 3.0和targetscan3.1,分析其可能作用的靶基因。选择在CD34+CD38-差异较为显著的miR-129、miR-520h的进行作用靶基因的验证。首先合成与miRNAs结合的靶位点DNA序列及互补序列,并分别在两条寡核苷酸5’端悬垂添加Hind III和Spe I酶切位点;退火形成形成带酶切位点的双链插入序列,与线性化pMIR-REPORT荧光素酶(Luc)报告基因载体(pMIR-Luc)连接构建重组载体(pMIR-Luc-miR),并进行酶切及测序验证。重组载体(pMIR-Luc-miR)、标准化对照载体pMIR-REPORT-β-gal(pMIR-β-gal)与miRNAs前体(Pre-miRNAs)共转染HeLa细胞(实验组),72h后分别检测HeLa细胞的荧光素酶(Luc)和β半乳糖苷酶(β-gal)的活性,计算二者的比值(Luc/β-gal)。同时设立三个对照组(no miRNA空白对照组、Pre-miR-negative阴性对照组和Anti-miRNAs反证对照组),比较各组的Luc/β-gal比值,验证miRNAs作用靶点的真实性。5、miR-520h促进造血发育功能研究选择在CD34+CD38-造血干细胞中高表达的miR-520h,研究其在促进造血发育中的作用。流式细胞仪分选的CD34+细胞,miR-520h转染CD34+细胞,转染后24h行CFC实验检测CD34+细胞集落形成能力改变,转染后72h行FACS检测CD34+、CD34+CD38-细胞比例变化,同时设立三个对照组(no miRNA空白对照组、Pre-miR-129阴性对照组和Anti-miR-520h反证对照组),分析miR-520h在促进造血发育中的作用。研究结果1、成功研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片整个点阵分成4个亚阵,每个亚阵有23行,21列,点间距为185μm,点的直径约为130μm。每条探针重复三次。为保证实验的可靠性,在芯片的不同部位多次设定各种对照,经点样后芯片共有1754个位点,包含469个miRNAs序列,总共588个基因(每个基因重复3个位点)。2、CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs的筛选与CD34+细胞miRNAs表达微阵列比较,HSC细胞共筛选出31个miRNAs,其中4倍低于CD34+细胞的miRNAs为22个(包括miR-129等),4倍高于CD34+细胞的miRNAs为9个(包括miR-526b*和miR-520h等) ,其中预测的miRNAs (PREDICTED_MIR)为4个。3、实时荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)对miRNAs芯片结果的验证选取6个CD34+CD38-造血干细胞中差异表达的miRNAs,以Q-RT-PCR加以验证,与芯片结果的吻合率达到50%,两种实验结果相符的miRNAs为:CD34+CD38-造血干细胞低表达的miR-129和CD34+CD38-造血干细胞中高表达的miR-526b*和miR-520h,相对于CD34+细胞的相对表达率分别为0.160±0.005、2.276±0.058和5.596±0.861。4、生物信息学分析及miRNAs作用靶点的验证利用在线软件Pictar、miRanda 3.0和targetscan3.1分别预测miR-129、miR-526b*和miR-520h的作用靶基因。结果发现,①miR-129在人、鼠、狗、猩猩、鸡等动物中保守存在33个可能的靶基因,包括EIF2C3、CAMTA1、SH3KBP1、TGIF2、ING3、DLGAP2等与miRNA加工、转录因子、信号转导等相关的基因。②miR-526b*仅在人类存在,其可能的作用靶点有771个,包括ABCG2、EIF2C3、CAMK4、CSF2RA等关于信号转导、转录因子、造血发育、凋亡调控、干细胞功能维持、miRNAs加工成熟的基因。③miR-520h共有226个可能的作用靶点,在人类、小鼠和类人猿中保守的靶基因共有30个,包括ABCG2、ID 1 (DNA结合抑制剂1)、SRP19 (一种信号识别蛋白)以及SMAD6 (一种转录调控因子)等与干细胞功能维持、转录、信号转导等相关的调控蛋白。选取miR-129可能的作用靶点EIF2C3和CAMTA1、miR-520h可能的作用靶点ABCG2和SMAD6进行验证。利用pMIR-REPORT荧光素酶报告基因载体,经酶切鉴定和测序验证,分别成功构建四种重组载体: pMIR-Luc-miR129-EIF2C3、pMIR-Luc-miR129-CAMTA1、pMIR-Luc-miR520h-ABCG2和pMIR-Luc-miR520h-SMAD6。pMIR-REPORT荧光素酶报告基因系统进行作用靶点验证实验表明,三个对照组(no miRNAs空白对照组、Pre-miR-negative阴性对照组和Anti-miRNAs反证对照组),Luc/β-gal比值接近。实验组,miR-129对于EIF2C3和CAMTA1,荧光素酶活性分别下降41%和47%,表明EIF2C3和CAMTA1都是miR-129的真实作用靶点;miR520h对于ABCG2和SMAD6,荧光素酶活性分别下降68%和27%,表明ABCG2是miR-520h的真实作用靶点,而miR-520h对SMAD6的抑制能力作用较弱。5、miR-520h促进造血干细胞发育功能研究CFC实验:三个对照组(no miRNAs空白对照组、miR-129阴性对照组和Anti-miR-520h反证对照组),各种祖细胞集落和集落总数均相近,其中空白对照组CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM和集落总数分别为28.50±4.32、37.83±5.60、57.67±5.16、1.50±0.55和145.50±14.35,实验组分别为37.83±7.70、46.5±4.85、68.17±7.73、1.67±0.52和174.33±17.82。经方差分析表明,CFU-E、BFU-E、CFU-GM和集落总数有显著统计学差异(P<0.05,n=6)。FACS分析:三个对照组CD34+和CD34+CD38-细胞比例相近,其中空白对照组CD34+和CD34+CD38-细胞比例为22.91%±2.03和12.57%±0.81,而实验组则为30.43%±2.34和13.08%±1.08。经方差分析表明,实验组CD34+细胞比例较高,有统计学差异(P<0.05,n=6),而CD34+CD38-比例相差不大,无统计学差异(P>0.05,n=6)。实验表明miR-520h具有促进造血干细胞发育和分化的功能。结论1、成功研制新型哺乳动物miRNAs检测芯片,表明利用miRNAs基因芯片来获取CD34+CD38-造血干细胞相关miRNAs是可行的,也为研究其它成体干细胞miRNAs表达谱建立了技术平台。2、筛选到CD34+CD38-造血干细胞发育相关miRNAs表达谱,并部分经实时定量RT-PCR验证,为探讨miRNAs参与CD34+CD38-造血干细胞发育分子机制和生物功能研究奠定了基础。3、验证了miR-129和miR-520h部分作用靶点,表明miRNAs通过调控EIF2C3、CAMTA1、ABCG2等在miRNA加工、转录因子、信号转导、干细胞功能维持等方面的靶基因,从而参与造血干细胞的发育,并形成miRNAs基因网络,在造血干细胞发育进程中起着协同或者拮抗作用。4、miR-520h具有显著的促进造血干细胞发育和向祖细胞分化的作用。研究结果不仅对miRNAs作为促进造血发育的分子靶点的探索具有重要的应用前景,而且对于发育生物学、发展组织工程和再生医学都具有重要的理论意义。