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蓝舌病（Bluetongue,BT）是一种世界动物卫生组织（World Organization for Animal Health,OIE）法定通报的反刍动物疫病,可给流行国家或地区带来重大的经济损失。自1979年首次发生BT疫情以来,我国已有31个省市地区发生过BT,而且存在的蓝舌病病毒（Bluetongue Virus,BTV）血清型众多,其中主要流行的血清型为1型和16型。鉴于其重大危害,预防和控制BT成为了世界各国重大动物疫病研究的热点。为筛选出一种安全、高效且具有DIVA（Differentiating Infected from Vaccinated Animals,DIVA）特性的疫苗,本研究通过昆虫杆状病毒表达系统分别制备BTV16核心样颗粒（Core-like Particles,CLPs）和病毒样颗粒（Virus-like Particles,VLPs）,同时原核表达和纯化出BTV16 VP2蛋白,并对三者的免疫效果进行初步评价。本研究将BTV16 VP3与VP7基因片段插入至昆虫杆状病毒穿梭载体pFastBac-Dual中,构建重组质粒pFastBac-Dual-VP3-VP7,并通过转座获得重组杆状病毒质粒Bacmid-VP3-VP7,随后转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-VP3-VP7。将rBac-VP3-VP7感染sf9细胞,72 h后收集细胞裂解上清,利用蔗糖梯度离心进行纯化。负染后通过透射电镜观察纯化产物的形态,并通过Western blot验证其反应原性。结果显示,透射电镜下可以观察到纯化产物中含有大量的与BTV形态相似的直径为65～70nm的中空颗粒,以绵羊BTV16阳性血清为一抗的Western blot可以检测到大小分别为100 k Da和38 k Da的2条蛋白条带,分别与BTV16 VP3和VP7蛋白大小一致。上述结果表明,本研究获得了具有良好反应原性的BTV16 CLPs。为制备BTV16 VLPs,本研究对载体pFastBac-Dual进行了改造,使其具有4个含独立启动子的多克隆位点（Multiple Cloning Site,MCS）,改造后的穿梭载体命名为pF4。依次将BTV16 VP2、VP5、VP3和VP7基因插入到pF4的4个MCS中,构建重组质粒pF4-VP2-VP5-VP3-VP7。通过将该质粒转化感受态细胞DH10Bac,随后转染sf9细胞,获得重组杆状病毒rBac-VP2-VP5-VP3-VP7。将该重组杆状病毒感染sf9细胞,72 h后收集细胞裂解上清,利用蔗糖梯度离心进行纯化。负染后通过透射电镜观察,并通过Western blot验证纯化产物的反应原性。结果显示,透射电镜下可以观察到纯化产物中含有具有典型BTV形态的直径为70～80 nm的中空颗粒,以绵羊BTV16阳性血清为一抗的Western blot可以检测到大小分别110 k Da、100 k Da、60 k Da和38 k Da的4条蛋白条带,分别与BTV16 VP2、VP3、VP5和VP7蛋白大小一致。结果表明,本研究成功制备出具有良好反应原性的BTV16 VLPs。本研究通过构建的重组原核表达质粒pET32-VP2在大肠杆菌中表达,并以亲和层析纯化制备BTV16 VP2重组蛋白。将制备的BTV16 CLPs、BTV16 VLPs和BTV16 VP2重组蛋白分别免疫小鼠,并以间接ELSIA方法和微量中和试验分别检测免疫后小鼠的BTV特异性抗体和中和抗体水平。结果显示,2次免疫后,BTV16 CLPs、BTV16 VLPs和BTV16 VP2蛋白刺激产生的特异性抗体效价相同,均为1∶128;而三者免疫小鼠产生的中和抗体效价存在较大差异,BTV16 CLPs无法刺激机体产生中和抗体,BTV16VLPs免疫产生的中和抗体效价为1∶64,BTV16 VP2蛋白免疫产生的中和抗体效价小于1∶16。这一结果表明,BTV16 VLPs可作为一种BTV16备选疫苗。在筛选备选疫苗的同时,为建立一种BT鉴别诊断方法,本研究构建了重组原核表达质粒pETDuet-NS3,在大肠杆菌中成功表达BTV NS3重组蛋白,经亲和层析纯化获得NS3重组蛋白。以纯化的NS3重组蛋白为包被抗原,经过对包被浓度、样品稀释度、二抗浓度和作用时间等一系列条件优化,建立了一种用于检测BTV抗体的间接ELISA方法,并对该方法进行了特异性、敏感性及重复性试验,初步组装成试剂盒。结果显示,该试剂盒可检出1∶1280稀释后的阳性血清;批内变异系数介于3.28%到9.43%之间、批间变异系数介于3.19%到12.96%之间,具有良好的重复性。与IDEXX ELISA试剂盒对比检测的结果显示,两者的BTV阳性样品符合率为100%,本研究研制的试剂盒可以区分BT自然感染和灭活疫苗免疫动物。本研究成功制备出BTV16 CLPs、BTV16 VLPs和BTV16 VP2蛋白,并将三者免疫小鼠后,对三者的免疫效果进行评价,确定BTV16 VLPs为候选疫苗。与此同时,本研究建立了一种可鉴别检测BTV灭活疫苗或其他具有DIVA特性疫苗的免疫动物和自然感染动物的诊断试剂盒,为进一步完善我国BT诊断技术体系和疫苗奠定了基础。