【摘 要】
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肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌的发病率和死亡率均居全世界癌症之首。肺癌患者的早期症状不明显,诊断相对困难。多数肺癌患者发现时已是晚期,而肺癌晚期患者容易发生骨转移。研究表明,肿瘤骨转移与骨微环境有密切的关系,骨骼中富含生长因子的环境有助于原发性肿瘤细胞向骨或骨髓迁移,为肿瘤细胞生存和生长提供了独特的微环境。在骨组织的细胞中,成骨细胞被证明是重要的肿瘤骨转移的参与者,其分泌的许多特异性蛋白
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肺癌是最为常见的恶性肿瘤之一,近年来肺癌的发病率和死亡率均居全世界癌症之首。肺癌患者的早期症状不明显,诊断相对困难。多数肺癌患者发现时已是晚期,而肺癌晚期患者容易发生骨转移。研究表明,肿瘤骨转移与骨微环境有密切的关系,骨骼中富含生长因子的环境有助于原发性肿瘤细胞向骨或骨髓迁移,为肿瘤细胞生存和生长提供了独特的微环境。在骨组织的细胞中,成骨细胞被证明是重要的肿瘤骨转移的参与者,其分泌的许多特异性蛋白在肿瘤细胞骨转移过程中起到重要作用。已有的文献表明网钙结合蛋白1（Reticulocalbin 1,RCN1）在肿瘤细胞增殖与迁移过程中发挥重要作用,但是其是否参与骨转移的过程尚且缺乏研究。本课题计划通过探讨成骨细胞是否能够通过分泌RCN1,进而调控肺癌细胞的增殖与迁移,初步明确RCN1在肺癌骨转移中的意义。首先,培养人与大鼠成骨细胞,获得条件培养基并处理肺癌NCI-H1299与NCI-H460细胞株,通过MTT,集落形成,RT-PCR,Transwell和WB等实验检测肺癌细胞增殖和迁移指标。随后,通过蛋白质非标定量技术（Label free）检测人与大鼠成骨细胞条件培养基的主要成分,并对其进行蛋白聚类分析,结果发现条件培养基中网钙结合蛋白1（Reticulocalbin 1,RCN1）的蛋白水平较高;梯度离心获取成骨细胞外泌体并WB方法检测外泌体相关特征指标与RCN1的表达状况;TCGA数据库推断RCN1的表达水平与肺癌患者的生存率间的关系;敲低成骨细胞内RCN1的培养基培养肺癌细胞,检测肺癌细胞内RCN1的表达变化等实验,确定RCN1在成骨细胞培养基调控肺癌细胞增殖与迁移中的表达意义。在上述实验基础上,肺癌细胞中敲低或过表达RCN1,检测肺癌细胞的增殖和迁移指标,并初步探讨肿瘤细胞内RCN1可能的作用机制;成骨细胞的培养基是否能够部分缓解肺癌细胞敲低RCN1对增殖与迁移的影响。此外,裸鼠左腿胫骨进行体内成瘤实验,小动物成像检测敲低RCN1的肺癌细胞在骨髓腔内的生长情况。我们的研究结果表明:（1）成骨细胞的条件培养基可以促进肺癌细胞的增殖和迁移。（2）成骨细胞的条件培养基中RCN1的蛋白水平相对较高,并存在于外泌体中;敲低RCN1的成骨细胞的培养基不能促进肺癌细胞的RCN1表达。（3）在肺癌细胞中敲低RCN1,可以抑制肺癌细胞的增殖与迁移;过表达RCN1可以促进肺癌细胞的增殖与迁移;敲低RCN1提高肺癌细胞的内质网应激和细胞自噬水平;成骨细胞条件培养基可部分缓解肺癌细胞内敲低RCN1对细胞增殖与迁移的促进作用。（4）敲低RCN1的肺癌细胞抑制其在裸鼠胫骨骨髓腔内肿瘤生长,但目前只有预实验结果,需要进一步的动物实验进行验证。通过上述实验,我们证实成骨细胞分泌的RCN1能够促进肺癌细胞的增殖和迁移;RCN1通过调节肺癌细胞中内质网应激和自噬水平,调控其增殖和迁移能力。据此推测,靶向成骨细胞的RCN1可能成为干预肺癌骨转移的新治疗选择。
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