研究背景在高温环境下工作会带来认知功能下降的问题,高温环境下官兵出现反应速度、记忆力、注意力等下降的现象。在动物模型的研究上也发现,热应激大鼠和小鼠出现学习能力、长期、短期记忆力下降,反应速度变慢等现象。而这个现象出现的主要原因是热应激导致海马神经元部分细胞器损伤,细胞膜卷曲,胞体肿胀,细胞核固缩,凋亡相关蛋白表达增多,凋亡现象增多。其中线粒体的损伤起到重要作用,热应激致线粒体膜电位去极化,氧化应激加重,呼吸复合体功能障碍,并导致细胞色素C释放到细胞质中,最终导致神经元出现功能障碍和凋亡。研究发现,高温环境下的营养代谢特点也有别于常温环境,高温环境作业人群B族维生素、维生素C等流失增多,钙、锌微量元素缺乏,热应激小鼠血浆脂质过氧化代谢产物明显增多。而某些营养素和食源性功能化合物被发现在改善高温环境下认知上具有一定作用,因此可以考虑用额外的营养补充来帮助解决高温环境下认知功能下降的问题,在补充方法上,多种物质组成的配方可以作用不同的靶点,效果往往比单一成分的营养补充更好。本研究旨在探索能够改善热应激小鼠认知能力的营养素和食源性功能化合物配方,并初步研究其作用机制,为进一步研制提升高温环境下脑力作业能力的营养补充剂,提高部队战斗力提供基础。研究目的1.研究热应激对小鼠认知功能的影响。2.筛选能够改善热应激小鼠认知功能的营养素及食源性功能化合物,组成配方并验证作用效果。3.重点关注线粒体在热应激致认知功能下降中的作用,对相关配方作用机制进行初步研究。研究方法1、动物分组及干预热应激小鼠模型:实验动物采用雄性8周龄SPF级C57 BL/6小鼠。环境适应5天后,随机分为3组,分别是对照组,热应激1组和热应激2组,实施持续7天的不同条件热暴露,其中对照组不进行热暴露;热应激1组热暴露温度42.5±0.5℃,相对湿度60±10%,每日1 h;热应激2组热暴露温度41±0.5℃,相对湿度60±10%,每日2 h。每日热暴露后1 h开始行为学实验。营养素及食源性功能化合物干预:小鼠适应期过后,随机分为对照组、热应激组和各营养素及食源性功能化合物干预组,开始灌胃。对照组、热应激组以生理盐水灌胃,持续21天。其余各组灌胃情况如下:羟基酪醇醋酸酯（HT-ac）:50 mg/kg/d,21天;（R）-3-羟基丁酸乙酯（HBET）:33.7 mg/kg/d,21天;L-酪氨酸:300 mg/kg/d,14天;B族维生素:维生素B1/B2/B6 5.5 mg/kg/d,泛酸13.75 mg/kg/d,B12 0.00925mg/kg/d,14天;槲皮素:16 mg/kg/d,14天;白藜芦醇:50 mg/kg/d,14天;茶多酚:250 mg/kg/d,14天;染料木素:230 mg/kg/d,14天;黄芩素:300 mg/kg/d,14天;木犀草素:285 mg/kg/d,14天;原花青素:300 mg/kg/d,14天;柚皮苷:100mg/kg/d,14天。灌胃最后7天同时实施温度42.5±0.5℃,相对湿度60±10%,每日1h的热暴露。每日热暴露后1 h开始行为学实验。营养素及食源性功能化合物配方干预:小鼠适应期过后,随机分为各营养素及食源性功能化合物配方干预组,开始灌胃。灌胃情况如下:高剂量植物化学物配方组:原花青素300 mg/kg/d,柚皮苷100 mg/kg/d,槲皮素16 mg/kg/d,21天;低剂量植物化学物配方组:原花青素100 mg/kg/d,柚皮苷40 mg/kg/d,槲皮素8 mg/kg/d;食品营养强化剂配方组:L-酪氨酸300 mg/kg/d,维生素B1/B2/B6 5.5 mg/kg/d,泛酸13.75mg/kg/d,B12 0.00925 mg/kg/d,21天;线粒体营养素配方组:HT-ac 50 mg/kg/d,HBET33.7 mg/kg/d,21天。灌胃最后7天同时实施温度42.5±0.5℃,相对湿度60±10%,每日1 h的热暴露。每日热暴露后1 h开始行为学实验。2、行为学实验Morris水迷宫实验:水池划分为四个象限,实验从热暴露当天开始,分为两个阶段:（1）定位航行实验:将小鼠按随机顺序从四个入水点放入水池,记录登上平台所需时间和游泳路程,以4次训练的平均值作为小鼠当日的成绩。（2）空间探索实验:定位航行实验结束24 h后,撤去平台,将小鼠从距离平台最远的点面向池壁放入水池,记录小鼠在平台所在象限的路程/时间百分比、穿越平台位置次数。穿梭实验:将小鼠放入实验箱自由活动5 min,随后开始实验循环,一个循环分为声光刺激期,声光电刺激期和静息期。小鼠在声光刺激期逃向安全区为主动逃避反应,声光电刺激期逃向安全区为被动逃避反应。实验分为两个阶段,训练阶段设定循环次数为20次,使小鼠可逐渐形成对主动逃避电击的记忆,训练结束24 h后进行实验,设定循环次数30次,记录小鼠主动逃避次数。跳台实验:将小鼠放至格栅上并通电,小鼠受到电击后会跳上绝缘平台,随后又可能再次跳至格栅上,受到电击又跳回平台。实验分为训练和实验两个阶段,训练时长5 min,使小鼠形成避免受电击的记忆,实验时长3 min,记录小鼠受电击次数。转棒实验:将小鼠放上滚筒,设置好转速、时间参数,开始转动,小鼠一旦掉落即受电击,以此促使小鼠尽力在滚筒上跑动。实验历时4天,前三天为训练,以训练至坚持1 min为成功标准;实验时以小鼠掉落或趴住滚筒连续转两圈以上为终止,每只小鼠进行3次实验,取平均时间为最终成绩。3、小鼠海马形态学观察HE染色:小鼠脑组织用4%多聚甲醛固定,石蜡包埋、切片。用苏木素-伊红染色、倒置光学显微镜观察海马神经元形态、排列,采集图像。Neu N免疫荧光染色:小鼠脑组织石蜡切片经脱蜡、抗原修复、封闭后,加一抗（Neu N）,二抗（绿色荧光）,再用DAPI复染后,用抗荧光淬灭封片剂封片,于荧光显微镜下观察海马神经元排列、Neu N阳性神经元,采集图像。透射电镜:小鼠海马切成1 mm~2小块,电镜固定液固定,锇酸后固定、脱水、渗透包埋、聚合处理后超薄切片,透射电镜观察线粒体超微结构,采集图像。4、生物信息学方法筛查食源性功能化合物以热应激、高温环境、认知功能、学习记忆、注意力等为检索关键词,通过数据库筛查和交叉比对,筛查出潜在作用靶点,通过PPI网络分析,根据节点数进行排序,通过KEGG分析共富集出可能的作用通路,按照相关性排序。以此为基础,通过Drugban以及Funfood数据库进行化合物匹配筛查。根据蛋白PPI网络中的重要靶点数量排序,如果相同则根据所有靶点数量排序。以此筛选出潜在食源性功能化合物。5、细胞培养和干预HT22小鼠海马神经元细胞系,在6孔板或96孔板中,使用10%FBS+1%双抗高糖DMEM培养基,在37℃,5%CO2培养箱中培养。培养至融合度约50%后,进行分组干预。Control:DMEM培养基;Heat Stress:DMEM培养基;HT-ac组:含10μM HT-ac的DMEM培养基;HBET:含25μM HBET的DMEM培养基;HT-ac+HBET:含10μM HT-ac和25μM HBET的DMEM培养基。再培养24 h后,除Control组外,其余组进行热处理,方法为更换新的培养基,将培养板放至加预热好的孔板加热器上（43℃,80 min）。干预结束后进行下一步实验。6、细胞活力、线粒体膜电位、活性氧、ATP检测细胞热暴露结束后,采用CCK8试剂盒进行HT22细胞活力检测。采用组织和细胞线粒体分离试剂盒分离纯化小鼠海马组织和HT22细胞线粒体,用JC-1试剂盒线粒体膜电位。采用ROS试剂盒检测HT22细胞活性氧水平。采用ATP试剂盒检测HT22细胞ATP水平。7、蛋白表达检测使用加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA裂解液提取小鼠海马和HT22细胞总蛋白,使用BCA试剂盒检测蛋白浓度,将各样本浓度稀释至相同。加入蛋白上样缓冲液混匀,煮沸变性后得到检测样品。Western Blot蛋白免疫印迹法检测蛋白表达,Odyssey近红外成像仪扫描显像,获取图像,使用Image J软件进行灰度分析。8、RNA检测Trizol试剂提取小鼠海马组织和HT22细胞总RNA,测定浓度并将各样本浓度稀释至相同,使用反转录试剂盒反转录得到c DNA模板。c DNA与水、引物、ROX Reference Dye、SYBR Green混合配置q PCR反应体系,进行扩增,根据Ct值采用2-ΔΔCT法进行相对定量。9、统计方法使用Graph Pad Prism 8.0软件进行数据统计分析和图表绘制。所有数据进行正态性和方差齐性检验。单因素试验结果符合正态分布和方差齐性的采用单因素ANOVA或t检验;符合正态分布,方差不齐的数据采用Brown-Forsythe检验;不符合正态分布的数据采用Kruskal-Wallis检验。重复测量数据采用重复测量方差分析。各处理组与热应激组和对照组比较采用Dunnett’s或LSD。P＜0.05认为差异有统计学意义。实验结果1、热应激小鼠认知功能下降,海马神经元损伤行为学实验结果显示,与对照组相比,热应激小鼠定位航行实验潜伏期和上台前路程延长（P＜0.05;P＜0.05）,学习和记忆获得能力下降;空间探索实验穿越平台次数变少,在平台所在象限游泳的时间和路程百分比下降（P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05）,空间记忆力下降;穿梭实验主动穿梭次数减少（P＜0.05）,记忆和判断能力下降;转棒实验时间未发生明显变化（P＞0.05）,运动协调能力未受影响。HE染色显示热应激小鼠海马CA1区神经元数量减少、细胞排列层数减少,海马神经元受损。Neu N免疫荧光显示热应激小鼠海马绿色荧光减弱,海马成熟神经元数量相对变少。2、营养素及食源性功能化合物预测和筛选靶点筛查和蛋白互作网络共筛查出潜在作用靶点93个,通过KEGG分析共富集出46条可能的作用通路,以此为基础,匹配筛查出128个营养素及食源性功能化合物。结构分类显示黄酮类占40%,酚类、萜类和生物碱类各占10%,酰胺类,糖苷类,醇类,酯类,氨基酸等共占30%。根据涉及潜在靶点数的化合物排序,选择L-酪氨酸、HT-ac、HBET、B族维生素(维生素B1、B2、泛酸、B6、B12)、槲皮素、白藜芦醇、茶多酚、染料木素、黄芩素、木犀草素、原花青素和柚皮苷作为潜在筛查对象。定位航行实验显示,与热应激组相比,L-酪氨酸组和柚皮苷组潜伏期缩短（P＜0.05;P＜0.01）,B族维生素组、L-酪氨酸组和柚皮苷组上台前路程减少（P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01）,学习和记忆获得能力有一定程度改善。空间探索实验结果显示,相比热应激组,HBET组、L-酪氨酸组、B族维生素组、槲皮素组、黄芩素组、原花青素组和柚皮苷组在平台象限游泳的时间和路程百分比提高（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01）,HT-ac组、L-酪氨酸组、B族维生素组、槲皮素组、白藜芦醇组、黄芩素组、原花青素组和柚皮苷组穿越平台次数增加（P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01;P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01）,空间记忆能力有一定程度改善。最终选择HT-ac、HBET、L-酪氨酸、B族维生素、槲皮素、原花青素、柚皮苷作为配方的组成部分。3、配方效果验证组成四个营养素及食源性功能化合物配方:（1）高剂量植物化学物配方（Phy-H,由原花青素,柚皮苷和槲皮素组成）;（2）低剂量植物化学物配方（Phy-L,由原花青素,柚皮苷和槲皮素组成）;（3）食品营养强化剂配方(Nut,由L-酪氨酸,维生素B1/B2/B6/B12和泛酸组成);（4）线粒体营养素配方（HT-ac+HBET,由HT-ac和HBET组成）。以Morris水迷宫实验、穿梭实验和跳台实验验证效果,结果显示,与对照组相比,HT-ac+HBET组和Nut组定位航行实验潜伏期缩短（P＜0.05;P＜0.05）,上台前路程减少（P＜0.01;P＜0.05）,学习和记忆获得能力提高;HT-ac+HBET组、Phy-H组和Nut组空间探索实验平台象限路程及时间百分比提高（P＜0.05;P＜0.01;P＜0.01）,穿越平台次数增多（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05）,空间记忆力得到改善;HT-ac+HBET组和Phy-H组穿梭实验主动穿梭次数增多（P＜0.01;P＜0.05）,记忆和判断能力提高;各配方组跳台实验错误次数均减少（P＜0.01;P＜0.05;P＜0.01;P＜0.001）,记忆保持能力提高。总的来说,低剂量植物化学物配方部分行为学实验结果相对热应激组有改善趋势,但无明显改善作用;高剂量植物化学物配方、食品营养强化剂配方和线粒体营养素配方3个配方作用效果较好。4、HT-ac和HBET联合应用改善神经元形态及线粒体功能对小鼠海马进行观察并检测线粒体膜电位。与热应激组相比,HE染色结果显示,HT-ac+HBET组CA1区细胞形态更完整,神经元排列更整齐;Neu N免疫荧光结果显示,HT-ac+HBET组绿色荧光更强,成熟神经元百分比提高（P＜0.05）;透射电镜观察结果显示,HT-ac+HBET组线粒体形态结构基本完整,外膜和嵴缺损现象较轻;JC-1结果显示,HT-ac+HBET组线粒体膜电位显著上升（P＜0.01）。检测HT22细胞线粒体膜电位及功能。与Heat Stress组相比,CCK8检测结果显示,HT-ac+HBET组细胞活力提升（P＜0.01）;JC-1、ATP和活性氧检测结果显示,HT-ac+HBET组细胞线粒体膜电位和ATP含量上升（P＜0.01;P＜0.05）,细胞内活性氧水平下降（P＜0.001）。5、HT-ac和HBET联合应用抑制线粒体凋亡通路激活小鼠海马q PCR和Wstern blot结果显示,与热应激组相比,HT-ac+HBET组Bad、Bax和Caspase-3 m RNA表达下调（P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01）,Bcl-2 m RNA表达上升（P＜0.001）;Bax表达下降（P＜0.01）,Bcl-2表达上升（P＜0.01）,Caspase-3表达下降（P＜0.05）,胞浆Cyt C含量下降（P＜0.05）。表明HT-ac和HBET联合应用可能抑制了热应激小鼠海马线粒体凋亡通路的激活。HT22细胞Wstern blot实验显示,与Heat Stress组相比,HT-ac+HBET组Bax表达下降（P＜0.05）,Bcl-2表达上升（P＜0.05）,剪切激活的Caspase-3表达下降（P＜0.01）,胞浆Cyt C含量下降（P＜0.001）。表明HT-ac和HBET联合应用可能抑制了热暴露HT22细胞线粒体凋亡通路的激活。6、HT-ac和HBET联合应用抑制PKA/CREB/BDNF通路下调小鼠海马Wstern blot实验显示,与热应激组相比,HT-ac+HBET组PKA、磷酸化CREB和BDNF表达上升（P＜0.01;P＜0.01;P＜0.05）。表明HT-ac和HBET联合应用可能抑制了热应激小鼠海马PKA/CREB/BDNF通路下调。HT22细胞Wstern blot实验显示,与Heat Stress组相比,HT-ac+HBET组PKA、磷酸化CREB和BDNF表达上升（P＜0.05;P＜0.05;P＜0.01）,表明HT-ac和HBET联合应用可能抑制了热暴露HT22细胞PKA/CREB/BDNF通路下调。结论本研究建立了热应激小鼠模型,利用生物信息学方法和行为学实验对营养素和食源性功能化合物进行预测筛选,并组成了3个有效的配方,同时对线粒体营养素配方的作用机制进行了初步研究,主要结论如下:1.热应激可致小鼠认知功能下降和海马神经元及线粒体损伤。2.由槲皮素、原花青素、柚皮苷组成的植物化学物配方;B族维生素、L-酪氨酸组成的食品营养强化剂配方;HT-ac和HBET组成的线粒体营养素配方对热应激小鼠认知功能下降具有改善作用。3.HT-ac和HBET联合应用可能通过抑制海马PKA-CREB-BDNF通路表达下调来对Bax/Bcl-2表达进行调节,抑制线粒体凋亡通路,从而维持线粒体膜电位和功能,减少海马神经元损伤,改善热应激小鼠认知功能。