研究背景:肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）是我国非成熟死亡（特定人群平均寿命前死亡）的主要原因,我国HCC发生的主要危险因素是慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus,HBV）感染。体细胞和HBV的共同进化是HBV相关HCC（HBV-HCC）发生发展的基础。体细胞和HBV基因组的突变以及HBV基因整合在HCC进化过程中高频出现并不断积累,从而赋予细胞生存优势并诱导肿瘤发生发展。目前对HCC体细胞突变和HBV整合的研究主要集中在核基因组,缺乏对线粒体基因组的突变以及HBV整合的研究。载脂蛋白B m RNA编辑酶催化多肽3（apolipoprotein B m RNA-editing enzyme catalytic polypeptides 3,APOBEC3）是人体内的主要促突变分子之一,APOBEC3在慢性炎症环境下被激活,可诱导体细胞和病毒发生APOBEC特征性突变,即产生APOBEC标签突变。APOBEC标签突变在乳腺癌、多发性骨髓瘤、前列腺癌和头颈部鳞癌等癌症的核基因组中显著富集,而在HBV-HCC核基因组中富集较少,但在HBV-HCC线粒体基因组中存在大量符合APOBEC突变特征的C:G＞T:A突变。线粒体的突变与异常代谢和肿瘤的发生相关,但APOBEC3相关的线粒体突变及代谢异常在HBV-HCC发生发展中的作用和机制尚缺乏深入研究。前期研究发现APOBEC3A/B的表达与全基因组HBV整合显著相关,APOBEC3A/B可能通过同时编辑HBV和细胞基因组导致HBV整合,但尚不清楚APOBEC3与线粒体HBV整合的关系。APOBEC3B单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）的易感基因型可促进高危HBV突变产生从而影响HCC的发生,但尚无研究证明APOBEC3A的SNP与HBV-HCC的关系。研究目的:本课题旨在探索APOBEC3通过促进线粒体单核苷酸变异（single nucleotide variant,SNV）及HBV整合导致线粒体代谢异常进而促进HCC发生发展的作用和具体机制,并筛选潜在的靶向抑制药物和预测预警标志物。APOBEC3A和APOBEC3B是与癌症基因组中APOBEC标签突变关联最密切的APOBEC3家族分子,因此本研究以APOBEC3A和APOBEC3B为主要切入点。围绕这一总目标,本课题的分项目标包括:阐明APOBEC3的表达与线粒体SNV和HBV整合之间的关系;研究HCC细胞中APOBEC3过表达对细胞恶性表型和细胞代谢的影响;筛选APOBEC3A和APOBEC3B的小分子抑制剂;分析线粒体基因及APOBEC3A的SNP与HCC发生风险的相关性。研究方法:1、对HCC组织样本进行高通量测序,分析线粒体SNV和HBV整合的分布规律及其与APOBEC3表达水平之间的关系。对48名HCC患者的癌和癌旁组织进行转录组测序,获取线粒体SNV和HBV整合的信息。使用配对t检验分析线粒体SNV和HBV整合数量的统计学差异;使用R语言的DESeq2包来分析基因表达水平差异;以Pearson相关性检验分析APOBEC3表达水平与线粒体SNV和HBV整合的相关性;以Log-Rank检验评价线粒体SNV和HBV整合对HCC患者复发的影响;通过GO和KEGG分析确定HBV-HCC ODX中APOBEC3A/B表达显著影响的信号通路和生物功能。2、探索APOBEC3A/B过表达对HCC细胞恶性表型、代谢以及线粒体变异的影响;筛选抑制APOBEC3A/B胞苷脱氨酶活性的化合物。使用Lipofectamine 3000 kit将APOBEC3A/B过表达质粒转染到Hep G2和Hep AD38细胞;采用Cell Counting Kit-8检测细胞增殖;Transwell检测细胞迁移;利用流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡;使用蛋白质印迹和实时荧光定量PCR检测细胞基因表达情况;采用代谢检测试剂盒（葡萄糖、乳酸、NAD+/NADH、NADP+/NADPH和谷氨酰胺）检测细胞代谢情况。通过APOBEC3A对单链DNA胞嘧啶的脱氨能力,在体外筛选能抑制APOBEC3A胞苷脱氨酶活性的化合物。3、采取病例对照研究方法分析线粒体基因及APOBEC3A的遗传多态性与HCC发生风险的相关性。使用荧光定量PCR的方法在1159例健康对照和2007例HBV感染者（包括934例HCC患者）中测定APOBEC3A两个SNP位点（rs12157810和rs1014971）和线粒体基因上的两个SNP位点（D-Loop区,rs41458645;ND3,rs2853826）的基因分型,用logistic回归计算SNP基因型与HCC发生风险的相关性。研究结果:1、RNA水平线粒体SNV及HBV整合在HCC中的分布及与预后的关系。在本研究队列HCC样本中,转录组测序检测到的线粒体SNV数量与HBV整合数量在癌和癌旁组织中分布不一致。APOBEC相关的C/G突变（C＞T/G或G＞A/C突变）在线粒体SNV中占43.3%,且在癌组织中数量显著高于癌旁组织（P=0.028）;严格意义上的APOBEC标签突变（TCW背景下的C＞T突变及其对应的G＞A突变）数量,同样在癌组织中显著高于癌旁组织（P=0.005）。本研究共检测到线粒体HBV整合突变519个占HBV整合突变总数的18.9%,在癌组织中线粒体HBV整合数量显著低于癌旁组织（P=0.011）。线粒体SNV及HBV整合与HCC预后之间的关系不同,在癌和癌旁组织中线粒体的C/G突变数量多均提示HCC早期复发,而在癌旁组织中的线粒体HBV整合数量少预示HCC早期复发。2、线粒体DNA编码基因的表达与线粒体SNV、HBV整合及HCC预后的关系。线粒体DNA编码基因在HCC癌组织中的表达均低于癌旁组织,线粒体DNA编码基因的低表达预示早期复发。线粒体APOBEC标签突变主要集中在CYTB、ND5、TRNQ、ATP6和ND1等基因,但APOBEC标签突变的数量与这些基因的表达水平没有相关性;而发生HBV整合频率最高的线粒体基因包括CYTB、COX1、ATP6、COX3和ND4等,线粒体HBV整合的数量与这些基因的表达正相关。3、线粒体SNV及HBV整合在RNA和DNA水平的一致性。在DNA和RNA水平检测HCC线粒体SNV和HBV整合的情况,发现线粒体的APOBEC标签突变位点在DNA和RNA水平高度重合（平均重合率达86.8%）,而线粒体的HBV整合未在DNA水平检测到。4、RNA水平线粒体SNV及HBV整合与APOBEC3表达的关系。癌和癌旁组织的基因差异表达分析显示,在HCC癌组织中APOBEC3A的m RNA水平下调;在癌和癌旁组织中RNA水平线粒体C/G突变和APOBEC标签突变的数量与APOBEC3A的表达负相关,而线粒体HBV整合数量与APOBEC3的表达没有相关性。5、HCC细胞系中APOBEC3A过表达对细胞恶性表型和代谢的影响。在Hep G2细胞中APOBEC3A过表达抑制细胞增殖和迁移,促进细胞凋亡和细胞周期S期阻滞,而在Hep AD38细胞中APOBEC3A过表达对细胞增殖、迁移以及凋亡无显著影响,但仍提示细胞周期S期阻滞。与对照细胞相比,Hep G2细胞过表达APOBEC3A后,细胞培养上清中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺和谷氨酸的浓度升高,细胞内NAD+/NADH低而NADP+/NADPH无显著差异;与对照细胞相比,Hep AD38细胞过表达APOBCE3A后,细胞培养上清中谷氨酰胺浓度降低,葡萄糖、乳酸和谷氨酸的浓度无显著差异,细胞内NADP+/NADPH降低而NAD+/NADH无显著差异。6、HCC细胞系中APOBEC3A过表达对线粒体DNA编码基因表达水平的影响。过表达APOBEC3A后分析Hep G2和Hep AD38细胞中线粒体发生高频APOBEC标签突变和HBV整合基因的表达情况,发现在Hep G2细胞中CYTB在m RNA和蛋白水平均下调;在Hep AD38中CYTB和COX1在m RNA和蛋白水平均上调。7、线粒体基因和APOBEC3A SNP与HCC发生风险的关系。校正年龄和性别因素后,线粒体基因ND3 SNP rs2853826与HBV-HCC的发生显著相关,该位点的G基因型能显著增加健康人群、肝硬化患者以及非HCC的HBV感染者（Non-HCC）的HBV-HCC发病风险（AOR分别为1.45,2.35和1.45）。APOBEC3A启动子区的SNP rs12157810位点的C等位基因显著降低健康人群和HBV感染患者的HCC发生风险（AOR分别为0.65和0.68）。位于APOBEC3A上游20kb的SNP rs1014971位点的T等位基因显著降低健康人群的HBV-HCC发病风险（AOR为0.82）。按性别或HBV基因型分层后rs2853826和rs1014971对HCC发生风险的作用主要体现在男性人群和C型HBV感染者中。研究结论:1、线粒体RNA水平的SNV主要来源于DNA水平的SNV转录形成。线粒体RNA水平与DNA水平的SNV高度重合,所以认为RNA水平的SNV是DNA水平的SNV转录形成;促进HCC发生发展的突变逐步累积,因此癌组织中SNV数量高于癌旁组织中的数量,且与不良预后正相关。2、线粒体的HBV整合是在RNA水平整合产生的,与DNA水平的HBV整合无关。线粒体RNA水平与DNA水平的HBV整合高度不重合,故可认为线粒体RNA水平的HBV整合是HBV直接攻击转录本导致的。因此线粒体RNA水平的HBV整合与线粒体DNA编码基因的m RNA水平相关,且线粒体RNA水平的HBV整合数量和线粒体基因表达与HCC复发的关系一致。3、APOBEC3A对肝癌细胞恶性表型和代谢的作用受HBV影响。在HBV缺失的情况下,APOBEC3A主要抑制细胞恶性表型。而在HBV存在时,APOBEC3A主要攻击复制活跃的HBV,促进谷氨酰胺的摄取和生物合成,因此APOBEC3A对肝癌细胞的恶性表型无明显影响。4、线粒体基因ND3的SNP（rs2853826）和APOBEC3A上游的SNP（rs12157810）与HBV-HCC的发生风险相关,rs2853826 G基因型主要在男性人群中增加HBV-HCC发生风险,rs12157810 C等位基因主要在男性人群和HBV C型感染者中降低HBV-HCC发生风险。