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【背景】高血压(hypertension)是以体循环动脉血压升高及血管张力持续增强为特征的慢性疾病,并且是多种心血管疾病与慢性肾功能衰竭的潜在危险因素。交感神经活动对维持血压和心血管功能具有重要作用,其过度激活是高血压重要特征之一。交感活动主要受脑干头端延髓腹外侧区(Rostral ventrolateral medulla,RVLM)调控,RVLM前交感神经元(因含有儿茶酚胺又称为C1神经元)不仅接受其他心血管中枢如室旁核、孤束核等纤维传入,并且能发出纤维直接调控脊髓中间外侧柱的交感节前神经元,从而影响心血管功能。因此,深入研究RVLM介导的交感输出亢进机制对于探索高血压发病机理和防治策略具有重要意义。研究证实RVLM氧化应激(oxidative stress)水平增加和神经炎症等改变都可引起交感神经的过度兴奋,同时RVLM前交感神经元的兴奋性也受到各类突触后受体的调节,包括血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)在内的多种G蛋白偶联受体(G protein-coupled receptors,GPCR)过度表达会引起交感神经亢进和血压升高。β-arrestin1是一种负向调控GPCR的多功能蛋白,主要通过介导受体的脱敏和内吞等途径阻断或减弱G蛋白偶联信号通路的持续激活。此外,研究显示β-arrestin1还可以通过非GPCR依赖的偏向性信号通路发挥多种心血管保护作用。前期,我们课题组已经发现与正常血压WKY大鼠相比,β-arrestin1在自发性高血压大鼠(Spontaneous hypertensive rat,SHR)RVLM中显著降低,并且证实β-arrestin1可通过抑制氧化应激降低交感神经活性和血压水平。然而,高血压状态下RVLM内β-arrestin1减少的原因和机制仍不清楚。Micro RNAs(mi RNAs)是一类非编码单链小RNA,主要通过直接结合靶蛋白的3’UTR区阻碍蛋白表达。在本研究中,我们通过Target Scan数据库预测mi R-22-3p可能与β-arrestin1基因(Arrb1)存在结合序列,且在心脏和脑等组织中广泛表达。研究证据显示mi R-22-3p与心房颤动、心力衰竭等心血管疾病密切相关,甚至被认为是不良临床结局的生物标志物。在中枢神经系统中,mi R-22-3p的异常改变可导致神经元损伤,并参与脑卒中和阿尔茨海默病的病理过程。然而,mi R-22-3p在交感中枢调控中的作用和意义仍不明确。因此,探索mi R-22-3p调控中枢心血管活动的方式和特点将有助于从转录后水平更好地阐明高血压的发病机制。小胶质细胞(microglia)是中枢神经系统的一类免疫细胞,可通过突触修剪或释放炎症因子等途径影响神经元功能。研究表明小胶质细胞可与RVLM前交感神经元产生协同作用以维持RVLM的正常生理功能,其异常激活是导致交感神经兴奋的重要原因,但小胶质细胞激活后是否通过mi RNAs途径影响RVLM前交感神经元的兴奋性仍未明确。基于以上研究背景及前期实验结果,本课题的总体假设如下:小胶质细胞参与调控RVLM内mi R-22-3p及β-arrestin1蛋白的表达,引起氧化应激增强,导致交感输出亢进和血压升高。本研究旨在从非编码RNA的角度探索高血压的发生机制,为高血压的防治策略提供了新思路。【方法】本研究包含动物实验与细胞实验。整体动物实验中选取正常血压的Wistar-Kyoto(WKY)大鼠和高血压大鼠SHR,均为雄性,周龄为16W,体重250-350 g。通过免疫荧光、Western blot(WB)确定β-arrestin1在RVLM的定位及表达差异。核团微量注射过表达β-arrestin1的腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV),测定大鼠血压、心率及血浆去甲肾上腺素水平,以明确β-arrestin1对心血管活动的调控作用。利用Target Scan数据库对β-arrestin1的上游mi RNA进行生物信息学预测,筛选出匹配程度高并在心脑血管系统高度表达的mi R-22-3p。荧光原位杂交及q PCR用于检测mi R-22-3p在RVLM的表达情况。为了探究mi R-22-3p在交感中枢的调控作用,分别在WKY与SHR RVLM内注射相关病毒过表达或下调mi R-22-3p,麻醉状态下股动脉插管进行血压、心率测定,取血浆通过ELISA测定NE水平,利用DHE染色对活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)进行检测。小胶质细胞的耗竭主要通过对动物进行混有PLX5622的特殊饲料喂养来实现。在细胞水平上,使用大鼠嗜铬细胞瘤细胞系PC12细胞(可模拟RVLM前交感神经元)进行验证,分别转染mi R-22-3p模拟物以及抑制剂,WB测定β-arrestin1的变化以及DCFH-DA探针测定细胞内活性氧水平;双荧光素酶实验检测mi R-22-3p与β-arrestin1之间的靶向关系。小胶质细胞相关实验在BV2细胞上进行。【结果】一、RVLM内mi R-22-3p对β-arrestin1的调控作用(一)RVLM内β-arrestin1的表达及心血管作用RVLM内神经元上存在β-arrestin1的表达,且SHR-RVLM内β-arrestin1表达低于WKY大鼠。中枢过表达β-arrestin1可降低SHR交感活动及血压水平。(二)mi R-22-3p可靶向结合β-arrestin1双荧光素酶报告基因实验证明mi R-22-3p与β-arrestin1的3’UTR区(411-418位点)存在靶向结合关系。(三)mi R-22-3p负向调控β-arrestin1的表达荧光原位杂交技术观察到RVLM存在mi R-22-3p的表达,且SHR-RVLM内mi R-22-3p表达高于WKY大鼠。在SHR-RVLM敲低mi R-22-3p表达后β-arrestin1水平升高;在WKY大鼠RVLM过表达mi R-22-3p后β-arrestin1表达显著下降。二、中枢mi R-22-3p负向调控β-arrestin1影响心血管功能(一)RVLM内上调mi R-22-3p引起交感亢进和血压升高WKY大鼠RVLM内过表达mi R-22-3p后,平均动脉压(Mean arterial pressure,MAP)(102.8±2.7 vs.125.1±2.8 mm Hg,P<0.05)、心率(Heart rate,HR)(354.2±11.3 vs.386.5±2.8 bpm,P<0.05)和血浆去甲肾上腺素(Norepinephrine,NE)水平(97.9±3.7 vs.154.6±11.0 ng/ml,P<0.05)明显升高。(二)RVLM内下调mi R-22-3p改善SHR心血管功能SHR-RVLM内下调mi R-22-3p表达后发现MAP(156.9±1.0 vs.134.3±1.2 mm Hg,P<0.05)、HR(393.7±3.4 vs.379.9±2.1 bpm,P<0.05)和血浆NE水平(146.9±5.4vs.110.0±5.1 ng/ml,P<0.05)显著降低。而WKY组RVLM内下调mi R-22-3p后MAP、HR及NE无显著变化。(三)RVLM内下调mi R-22-3p降低SHR氧化应激水平DHE检测显示SHR-RVLM下调mi R-22-3p后活性氧水平降低39.7%。(四)mi R-22-3p通过调控β-arrestin1影响PC12细胞氧化应激水平PC12细胞转染mi R-22-3p模拟物后β-arrestin1表达下降,ROS水平显著上升;用血管紧张素II(angiotensin II,Ang II)预处理的PC12细胞转染mi R-22-3p抑制剂,发现ROS含量显著降低;在此基础上,转染β-arrestin1 si RNA能阻断PC12细胞上mi R-22-3p抑制剂诱导的抗氧化应激效应。三、小胶质细胞参与调控RVLM中mi R-22-3p及β-arrestin1的表达(一)小胶质细胞参与调控RVLM内β-arrestin1表达荧光原位杂交实验显示mi R-22-3p在RVLM神经元和小胶质细胞上均存在表达。耗竭小胶质细胞后,RVLM内mi R-22-3p约下降64%,而β-arrestin1表达上升了2.24倍。(二)小胶质细胞的激活增加神经元mi R-22-3p的表达Ang II刺激小胶质细胞BV2可引起mi R-22-3p显著升高;用BV2细胞上清液培养PC12神经元,发现未激活的BV2上清液不能提高PC12细胞中mi R-22-3p水平,而用Ang II激活的BV2上清液培养PC12细胞,其mi R-22-3p表达量提高1.6倍。【结论】中枢mi R-22-3p负向调控β-arrestin1,引起氧化应激增强,导致交感输出亢进和血压升高;小胶质细胞参与调控RVLM内mi R-22-3p及β-arrestin1的表达。本研究结果提示了具有中枢抗高血压效应的β-arrestin1的上游调控机制,为高血压的防治策略提供了新的理论内容。