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第一部分实验性蛛网膜下腔出血后M1小胶质细胞激活变化目的:研究实验性蛛网膜下腔出血后M1小胶质细胞标志物及其数量变化。方法:实验1:将体重300-350克的Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠随机地分为假手术组和指定时间点的SAH组,分别为SAH诱导后1、6、12、24、48、72小时,一共7组,每组5只。大鼠麻醉后将其固定于立体定位仪上,采用向视交叉前池注入自体动脉血的方法建立体内蛛网膜下腔出血（Subarachnoid hemorrhage,SAH）模型。假手术组和SAH组的大鼠在对应的时间点实施安乐死。各组收集5只大鼠的颞底脑组织用于蛋白质印迹实验（Western-blot assay）以分析M1小胶质细胞生物标记物iNOS和CD86的蛋白表达。实验2:将BV-2细胞随机地分为2组,分别为:正常组和氧合血红蛋白（Oxyhemoglobin,OxyHb）诱导组,每组包括6个样本,每组细胞数量相等。使用OxyHb诱导BV-2小胶质细胞模拟体外SAH模型,于建模后24小时收集各组细胞并提取细胞蛋白用于进行Western-blot实验。结果:实验1:体内实验中,Western-blot实验结果显示:大鼠在蛛网膜下腔出血建模后72小时内,颞底脑组织中M1小胶质细胞的生物标记物CD86和iNOS的表达水平呈逐渐上升趋势（P＜0.01和P＜0.001）。实验2:体外实验中,Western-blot实验结果显示:与正常组相比,OxyHb处理24小时后小胶质细胞中的CD86和iNOS的表达水平明显上升（P＜0.001）。结论:在体内与体外SAH建模后,大鼠颞底脑组织和BV-2细胞中M1小胶质细胞标志物CD86和iNOS的蛋白表达水平呈明显上升趋势。以上结果提示,SAH引起M1小胶质细胞的激活。第二部分靶向iNOS对实验性蛛网膜下腔出血后神经炎症及脑损伤的影响目的:通过抑制iNOS的表达,观察其对SAH后M1小胶质细胞激活数量、神经炎症、脑水肿、神经元及神经功能的影响。方法:采用iNOS特异性抑制剂L-NIL开展如下实验。实验1:将117只SD雄性大鼠随机地分为3组,每组包括39只:假手术组,SAH组和SAH+L-NIL组。其中69只大鼠在SAH后24小时被实施安乐死,收集其脑组织分别用于:（1）Western-blot 实验分析 iNOS 表达水平;（2）免疫荧光染色实验观察 M1小胶质细胞数量;（3）实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）实验检测相关炎症因子表达水平;（4）Fluoro-JadeB（FJB）染色和尼氏染色实验观察神经元细胞死亡情况;（5）脑含水量实验检测脑水肿程度。另48只大鼠在处理后按特定时间点进行改良的Garcia测试、梁平衡测试、线握测试（Wire-griptest）和莫里斯水迷宫测试（Morris Water Mazetest）以评估神经功能。实验2:将BV-2小胶质细胞随机地分为3组:正常组、OxyHb组和OxyHb+L-NIL组,每组包括3个样本,每组细胞数量相等。于处理后24小时收集各组细胞并提取细胞蛋白用于进行Western-blot实验分析iNOS表达水平。结果:体内与体外Western-blot实验结果均显示:与实验组相比较,L-NIL处理后,iNOS蛋白表达水平呈下降趋势（P＜0.01和P＜0.001）。免疫荧光染色实验以iNOS与Iba-1共定位的细胞数占小胶质细胞总数的百分比作为分析指标,结果显示:与假手术组相比,大鼠在SAH建模24小时后的颞底脑组织中M1小胶质细胞数量增多（P＜0.01）;与SAH组相比较,L-NIL处理后使大鼠颞底脑组织中M1小胶质细胞数量减少（P＜0.01）。qRT-PCR实验结果提示:SAH建模后,相关炎症因子如TNF-α、IL-6以及IL-1β的表达水平呈上升趋势,而L-NIL的处理逆转了该趋势（P＜0.001和P＜0.0001）。FJB染色实验结果提示:与假手术组相比,SAH组中FJB 阳性的细胞数量增多,而L-NIL处理后FJB 阳性的细胞数量减少。在尼氏染色实验中,与假手术组相比,SAH组观察到更多的萎缩的神经元,L-NIL处理后改善了该情况。在脑含水量实验中,与假手术组相比,SAH后24小时的大鼠脑水分含量显著增加。SAH后左右大脑半球的脑水含量在用L-NIL处理后均降低（P＜0.05）。系列神经行为实验:（1）改良的Garcia测试、梁平衡测试结果显示:SAH诱导前,各组间神经系统评分无显著差异。SAH诱导后,与假手术组相比,SAH组的神经系统评分显著降低,并且在使用L-NIL后显著改善（P＜0.01）。（2）线握测试结果显示:与假手术组相比,SAH后大鼠的肌力在第1-7天表现出显著下降。用L-NIL处理后,SAH后大鼠的不良运动表现得到改善（P＜0.05和P＜0.01）。（3）莫里斯水迷宫测试结果显示:与假手术组相比,SAH组的学习记忆能力显著下降,而L-NIL治疗组则减轻了学习记忆能力的下降（P＜0.05,P＜0.01和P＜0.001）。结论:抑制iNOS的表达减少了 SAH后颞底脑组织中M1小胶质细胞的激活数量,缓解了神经炎症,减轻了脑水肿、神经元死亡以及神经功能损伤的程度,进而改善了 SAH的预后。第三部分靶向iNOS对减轻实验性蛛网膜下腔出血后神经炎症的机制研究目的:通过抑制iNOS的表达,探究其减轻实验性蛛网膜下腔出血后神经炎症的可能分子机制。方法:实验1:使用铁死亡的特异性抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1）开展如下研究。将BV-2小胶质细胞随机地分为6组,分别为:正常组,OxyHb组,OxyHb+DMSO组,OxyHb+DMSO+L-NIL 组,OxyHb+DMSO+Lip-1 组和 OxyHb+DMSO+L-NIL+Lip-1组。每组包括5个样本,每组细胞数量相等。于处理后24小时收集各组细胞分别用于进行:（1）Western-blot实验分析铁死亡相关蛋白表达水平;（2）C11-BODIPY581/591实验及丙二醛（MDA）含量实验检测脂质过氧化程度;（3）细胞计数实验（CCK-8）测定细胞活力。实验2:将HT22神经元细胞随机地分为3组,分别为:正常组,OxyHb组和OxyHb+L-NIL组。每组包括5个样本,每组细胞数量相等。于处理后24小时收集各组细胞用于进行Western-blot实验分析铁死亡相关蛋白及iNOS的表达水平。实验3:将9只SD雄性大鼠随机地分为3组,分别为:假手术组,SAH组和SAH+L-NIL组。在SAH建模24小时后收集各组大鼠脑组织后制成冰冻冠状脑切片用于双重免疫荧光染色实验,观察M1小胶质细胞中铁死亡相关蛋白表达水平变化。结果:体外Western-blot实验的结果显示:与正常组相比,暴露于OxyHb后铁死亡相关蛋白如转铁蛋白受体1（TfR1）、转铁蛋白（Tf）、铁蛋白重链（Fth）、铁蛋白轻链（Ftl）和环氧合酶2（Cox2）的表达上调,而谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）和胱氨酸谷氨酸反向转运蛋白（xCT）的表达下调。且在L-NIL处理后进一步增加了TfR1、Tf、Fth、Ftl和Cox2的表达,同时进一步降低了 GPX4和xCT的表达。而Lip-1处理下调了 TfR1、Tf、Fth、Ftl和Cox2的表达并上调GPX4和xCT的表达（P＜0.05,P＜0.01和P＜0.001）。体内免疫荧光染色实验进一步表明:SAH建模24小时后M1小胶质细胞中Cox2和TfR1的表达上调,而在L-NIL干预处理后则进一步增加了它们的表达。为了探讨上述改变是否与神经元发生铁死亡有关,采用HT-22神经元细胞培养发现:与小胶质细胞不同,HT-22神经元细胞经L-NIL处理后,其GPX4和xCT的表达水平没有显著差异;此时,HT-22神经元细胞在OxyHb刺激后iNOS的表达非常低。结论:抑制iNOS能在一定程度上增加M1小胶质细胞对铁死亡的易感性,减少了 M1小胶质细胞的数量,但未促进神经元的铁死亡。推测,这可能是靶向iNOS减轻神经炎症反应继而产生脑保护作用的分子机制。