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研究背景慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease,COPD）是全球范围内最常见的慢性呼吸道疾病,其特征是持续存在的呼吸系统症状和气流受限。气流受限呈进行性发展,肺功能减退,使患者的劳动力和生活质量严重受损,造成巨大的社会、经济和医疗负担。慢性阻塞性肺疾病急性加重（Acuteexacerbation of chronic obstructive pulmonary disease,AECOPD）是慢性阻塞性肺疾病患者病程中的一个重要事件,是患者反复住院及死亡的重要原因。急性加重最常见的诱发因素是呼吸道感染,尤其是呼吸道病毒感染。本课题组的既往研究结果及相关文献均提示流感病毒（以季节性流感病毒亚型H3N2为代表）是诱发慢阻肺急性加重最常见的诱发因素。因此,充分了解流感病毒是如何诱发慢阻肺急性加重的分子机制及如何参与到急性加重的发病过程至关重要。目前临床普遍使用的是针对流感病毒的神经氨酸酶抑制剂磷酸奥司他韦（Oseltamivir phosphate）,但近年来耐药菌株不断出现,治疗效果下降,开发新的流感病毒靶点药物或考虑联合其他的抗病毒药物是临床的急切需求。疏风解毒胶囊（Shufeng Jiedu Capsule,SFJDC）是一种具有广谱抗菌抗病毒作用及明确的抗炎、调节机体免疫功能的传统中成药物,在抗病毒作用中副作用小,没有最佳治疗窗限制,无耐药菌株,联合Oseltamivir作为一种新型的抗病毒治疗方案纳入我们的研究之中。因此,本课题的研究目的是调查慢阻肺急性加重的患者由流感病毒H3N2激活的气道炎症的分子机制和SFJDC联合Oseltamivir治疗的效果评估。研究方法本课题的主要研究方法分为四大部分:（1）从正常对照（Normal human bronchial epithelial cell,NHBE）和 COPD 患者的支气管组织（Diseased human bronchial epithelial cell-COPD,DHBE）中分离、纯化、鉴定和培养正常人和COPD患者的原代支气管上皮细胞;采用SPF级的鸡胚培养扩增甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）亚型H3N2;采用空斑实验测定病毒滴度;将原代支气管上皮细胞和IAV/H3N2共培养24h后提取细胞RNA逆转录后进行转录组高通量测序,根据表达量变化,区别出差异表达基因;针对差异表达基因NLRP3炎症小体信号通路展开研究:采用Western blotting检测流感病毒刺激后的NLRP3炎症小体信号通路的蛋白水平表达变化,其次添加siRNA和MCC950（NLPR3的特异性小分子抑制剂）,在细胞水平上证实流感病毒通过刺激慢阻肺患者的支气管上皮细胞激活NLRP3炎症小体信号通路。（2）健康对照组大鼠吸入清洁空气;采用烟熏法构建COPD大鼠模型,烟熏结束后,进行大鼠的尾动脉血气分析和无创肺功能检测;实验组大鼠鼻腔内滴加流感病毒H3N2,对照组大鼠鼻腔内滴加等量的生理盐水,并记为第0天;每日记录大鼠的体重和生物学行为变化;流感病毒感染后24h,向COPD大鼠气管内滴加MCC950;感染后第7天,将所有实验大鼠安乐死后,收集大鼠血清,灌洗大鼠右侧肺组织收集支气管肺泡灌洗液（Broncho-alveolar lavage fluid,BALF）标本;左肺部分组织脱水固定做石蜡切片,进行HE染色,观察肺组织损伤程度;剩余进行组织匀浆,采用实时荧光定量PCR和蛋白印迹检测NLRP3炎症小体信号通路的mRNA和蛋白水平的变化;采用酶联免疫吸附实验（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）检测大鼠的血清和BALF中的IL-1β和IL-18的表达水平,并将正常对照组和COPD组的数值进行比较。（3）收集流感病毒感染的COPD急性加重患者的外周血清和BALF,和同期收集的健康对照者比较IL-1β和IL-18的表达水平。进一步证实流感病毒感染COPD患者是通过激活NLRP3小体信号通路。（4）采用UHPLC/ESIQ-Orbitrap质谱法分析SFJDC的药物成份;将DHBE细胞与IAV共培养24h,随后给予合适浓度的SFJDC和/或Oseltamivir;合适的药物浓度通过MTT检测细胞活力进行判断;建立IAV感染的COPD的大鼠模型,采用SFJDC和/或Oseltamivir进行治疗,观察大鼠的生物行为学变化。采用实时荧光定量PCR和Western blotting印迹法检测NLRP3炎性小体信号通路的mRNA和蛋白水平变化。采用ELISA法测定血清和BALF中的IL-1β和IL-18的水平,综合判断SFJDC和/或Oseltamivir的治疗效果。研究结果课题研究结果主要分为四个部分:（1）成功分离、纯化、鉴定和培养正常对照和COPD患者的原代支气管上皮细胞,采用倒置光学显微镜观察细胞呈鹅卵石状,富表达上皮细胞特征性细胞角蛋白CK17/19（Cytokeratin 17/19）;原代支气管上皮细胞和IAV共培养24h的转录组高通量测序结果表明DHBE细胞中的NLRP3炎性小体信号通路在mRNA表达水平上显著高于NHBE;采用Western blotting蛋白印迹分析提示在DHBE中共培养IAV 3h后NLRP3水平即升高。在NHBE中共培养6h后,才能观察到表达量的变化。但是,两种细胞在接种后12h均达到NLRP3的峰值水平,并维持到24h。在这些细胞中,ASC,pro-caspase-1,caspase-1,pro-IL-1β,pro-IL-18,IL-1β和IL-18也以类似的时间依赖性模式升高。用NLRP3 siRNA和MCC950处理DHBE时,NLRP3炎性小体的mRNA和蛋白表达均显著降低。（2）在IAV感染的COPD大鼠肺组织中,NLRP3炎性小体信号通路表达水平也显著升高。用MCC950治疗可减轻肺部损伤,提高其存活率,减缓体重下降,降低NLRP3炎性小体信号通路蛋白的表达以及BALF中IL-1β,IL-18的水平。此外,相比于对照组,IAV感染的COPD大鼠的血清和BALF中IL-1β和IL-18水平也显著升高。（3）收集了 37例AECOPD患者的痰、鼻咽拭子、外周血清和BALF。排除痰细菌学检测阳性后共37例,鼻咽拭子流感病毒检测阳性的患者共18例,病毒检测阴性的对照组共19例。流感病毒检测阳性的AECOPD患者的外周血清和BALF中IL-1β和IL-18的表达量显著高于阴性对照组。两组间的FEV1/FVC的比值具有明显统计学差异。（4）疏风解毒胶囊和/或磷酸奥司他韦在合适的药物浓度范围内没有明显的细胞毒性。体外细胞实验结果提示,IAV和DHBE细胞共培养24h后,NLRP3炎性小体信号通路相关的mRNA和蛋白表达水平显著升高,用SFJDC和/或Oseltamivir治疗后,这些成份的mRNA和蛋白水平显著降低。体内实验表明,COPD大鼠鼻腔内滴加IAV后,SFJDC联合Oseltamivir用药可提高大鼠的生存率,显著减轻COPD大鼠的临床症状,增加大鼠体重,减轻肺损伤,降低血清和BALF中的IL-1β和IL-18 水平、NLRP3 炎症小体相关成份及肺组织中的流感病毒滴度。研究结论流感病毒通过体外和体内实验证明通过激活AECOPD患者支气管上皮细胞中的NLRP3炎性小体信号通路,诱发更早、更强的气道炎性反应,合理解释了为什么流感病毒感染可导致临床病例中较为严重和快速的疾病发展过程。MCC950可以特异性抑制NLRP3炎性小体信号途径,极大提高了大鼠的存活率并显著抑制气道炎症,为在AECOPD患者中寻找新的流感病毒治疗方法提供了有力的证据。同时,SFJDC和Oseltamivir的组合代表了一种新的治疗策略,可以提高IAV诱发的慢性气道疾病患者（尤其是AECOPD患者）的治疗效果和生活质量。