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背景及研究目的肝缺血再灌注损伤（hepatic ischemia reperfusion injury,HIRI）是导致肝移植术后肝功能障碍的重要因素。高达10%～30%的移植术后肝功能障碍可归咎于HIRI。因此,控制HIRI是改善肝脏术后肝功能的策略之一。早期免疫系统过度激活是HIRI的关键机制,而中性粒细胞迁移和过度聚集参与了这一病理生理过程。对中性粒细胞的研究可以为HIRI预防和治疗提供新的思路。白介素18及其受体（IL-18/IL-18R）在炎症和免疫应答中发挥重要作用。本研究前期通过基因芯片筛选发现肝移植患者术后中性粒细胞IL-18受体表达上调,由此推测IL-18受体信号可能在中性粒细胞介导的HIRI中发挥关键作用。趋化性是中性粒细胞的基本特性,其最重要机制为肌动蛋白微丝（fibrous actin,F-actin）,和肌球蛋白（myosin）的联合作用。Rho家族GTP酶（Rho family of GTPases）是Ras超家族的一员,可调节肌动蛋白骨架重组,主要包括Ras同源基因家族成员A（ras homolog gene family,member A,Rho A）、Ras相关C3肉毒毒素底物1（ras-related C3 botulinum toxin substrate1,Rac1）和细胞分裂周期蛋白42（cell division cycle42,Cdc42）。IL-18受体是否可以调控F-actin聚合,进而影响其趋化作用尚不清楚。本研究首先利用临床样本确定了外周血中性粒细胞IL-18受体表达变化与肝移植后HIRI的相关性;然后通过体外细胞实验探讨了IL-18受体表达与中性粒细胞细胞骨架蛋白F-actin聚合的关系;最后通过动物实验证实了IL-18受体在HIRI中的作用,从而为临床干预HIRI提供新的潜在靶点。研究方法1.检测肝移植患者术后外周血白细胞IL-18受体的表达情况（1）纳入肝移植患者作为研究对象,同期骨科手术患者为对照组,术后采集外周血样本。（2）检测两组人群术后24h中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞表面IL-18受体的表达水平。（3）检测肝移植患者手术当天及术后三天肝功能指标谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、碱性磷酸酶（AKP）、γ谷氨酰转肽酶（γ-GT）等,评估术后肝损伤的发生情况。（4）分析肝移植患者术后24h时中性粒细胞表面IL-18受体的表达水平与肝功能指标谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）的相关性。2.离体实验探讨IL-18受体对肝移植患者术后外周血中性粒细胞趋化运动的影响,并对下游信号通路及分子机制进行初步研究（1）肝移植患者术后24h时外周血中性粒细胞提取纯化及q RT-PCR验证中性粒细胞的纯化效率。（2）利用si RNA细胞转染方法敲减IL-18Rα,通过Transwell迁移实验检测中性粒细胞趋化功能的变化,通过蛋白免疫印迹检测中性粒细胞中Rho A、Rac1、Cdc42等小GTP酶的表达。（3）观察肝移植患者术后24h时外周血中性粒细胞F-actin荧光染色分布,从而证实IL-18Rα表达变化和中性粒细胞趋化性的关系。（4）分离肝移植患者术后24h及健康成人外周血中性粒细胞,利用免疫共沉淀检测Rho A、Rac1及Cdc42和IL-18受体的结合能力,以探讨IL-18受体调控中性粒细胞趋化性的信号通路。3.阻断中性粒细胞IL-18受体对小鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用（1）通过夹闭小鼠肝左叶及肝中叶肝门部脉管系统,建立小鼠70%肝脏缺血再灌注损伤模型,建立小鼠尾静脉注射给药模型。动物分为假手术组（Sham组）、缺血再灌注组（I/R组）、缺血再灌注+同型Ig G对照组（I/R+ISO组）、缺血再灌注+IL-18RAP抗体组（I/R+anti-IL-18RAP组）、缺血再灌注+中性粒细胞清除组（I/R+anti-Ly6G/Ly6C组）、缺血再灌注+IL-18RAP抗体+中性粒细胞清除组（I/R+anti IL-18RAP+anti Ly6G/Ly6C组）。其中,I/R+anti-Ly6G/Ly6C组和I/R+anti-IL-18RAP+anti Ly6G/Ly6C组小鼠术前24h经尾静脉注射Ly-6G/6C单克隆抗体100μg;I/R+anti-IL-18RAP组和I/R+anti-IL-18RAP+anti-Ly6G/Ly6C组小鼠术前24h经尾静脉注射IL-18RAP单克隆抗体100μg;I/R+ISO组小鼠术前24h经尾静脉注射同型Ig G（ISO）100μg。（2）各组小鼠再灌注6h时,通过流式细胞术检测肝脏缺血再灌注6h时外周血中性粒细胞计数变化、外周血IL-18浓度变化;测定血清ALT、AST;病理切片H＆E染色观察肝脏损伤程度;荧光法检测缺血部位肝组织MPO的表达变化;光镜观察肝脏缺血再灌注损伤区中性粒细胞浸润程度。研究结果1.肝移植患者术后外周血中性粒细胞IL-18受体的表达情况（1）与对照组相比,肝移植患者术后24h时外周血中性粒细胞IL-18Rα、IL-18RAP的表达显著上调,单核细胞IL-18Rα的表达无显著差异,淋巴细胞IL-18Rα的表达显著下调,单核细胞和淋巴细胞IL-18RAP表达均无显著改变。（2）与对照组相比,接受肝移植患者手术及第三天血清ALT、AST水平显著下降,术后第三天AKP水平显著升高,提示肝移植患者术后均存在一定程度的肝损伤。（3）将肝移植患者术后24h时外周血中性粒细胞表面IL-18Rα的表达分别与术后24h时ALT及AST进行相关性分析（Pearson相关分析）,结果提示IL-18Rα的表达与ALT及AST存在正相关性。2.IL-18受体对肝移植患者术后外周血中性粒细胞趋化功能的影响（1）和NC组相比,si-IL18Rα及si-IL18RAP干扰后中性粒细胞中IL-18Rα及IL-18RAP的m RNA表达均显著降低,提示转染及干扰效率满意。（2）和NC组相比,IL-18Rα敲减后中性粒细胞趋化功能明显下降。（3）和NC组相比,IL-18Rα敲减后与趋化相关的骨架蛋白F-actin聚合减少。（4）和NC组相比,IL-18Rα敲减后调控F-actin聚合及细胞迁移的小GTP酶Rho A、Rac1和Cdc42蛋白表达下调。（5）免疫共沉淀实验显示,IL-18RAP与Rho A和Cdc42存在相互作用,因此IL-18受体可能通过Rho A和Cdc42调控中性粒细胞的趋化运动。3.IL-18RAP中和抗体对小鼠肝缺血再灌注损伤具有保护作用（1）anti-IL-18RAP显著抑制肝缺血再灌注损伤小鼠外周血中性粒细胞数量及IL-18水平。（2）anti-IL-18RAP降低小鼠ALT、AST水平,改善模型小鼠肝脏功能。（3）anti-IL-18RAP降低小鼠肝脏组织MPO活性,降低肝组织病理评分。研究结论肝移植患者术后外周血中性粒细胞IL-18受体显著上调。离体实验结果显示IL-18受体与肝缺血再灌注损伤后外周血中性粒细胞的趋化作用相关,可能机制是通过调节小GTP酶Rho A、Rac1和Cdc42影响细胞内骨架蛋白F-actin的聚合完成的。动物实验结果表明IL-18RAP抗体在HIRI中具有保护作用,但是其并不能进一步增强中性粒细胞去除带来的肝损伤保护作用,提示IL-18受体介导肝缺血再灌注损伤的作用主要来源于中性粒细胞。本研究认为,中性粒细胞IL-18受体上调可能是肝缺血再灌注损伤的关键因素,其机制可能与小GTP酶增强中性粒细胞的趋化功能有关。