研究目的肾细胞癌（renal cell carcinoma,RCC）简称肾癌,是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一。肾癌发病隐匿,早期常无明显症状,且肾癌恶性程度较高,容易发生转移[1],大约17%的病人在初诊时已出现转移[2],其中最常见的转移部位是肺。转移是导致肾癌患者死亡最常见的原因之一。早期肾癌治疗以肾部分切除术或肾癌根治术为主,然而约30%的患者在手术后会发生局部复发或远处转移,严重威胁患者的生命健康。转移性肾癌的治疗手段有限,对传统的化、放疗敏感性较差,五年生存率仅为10%,是临床医生面临的棘手问题。随着以酪氨酸激酶抑制剂为代表的分子靶向药物,如舒尼替尼、索拉菲尼和帕唑帕尼等的应用,转移性肾癌患者的生存获益明显提高。由于肾癌具有很强的异质性,同样临床分期的患者对相同治疗方案的反应性可出现较大差异。然而,对分子靶向药物或免疫检查点抑制剂类药物原发耐药或获得性耐药使转移性肾癌的治疗面临挑战。同时,转移性肾癌发生发展的分子机制目前尚不清晰,目前也缺乏可早期发现预测并治疗转移性肾癌的有效靶点。因此,通过探索调控肾癌转移的生物学机制,并利用新型靶点进行早期干预和治疗,是目前亟待解决的科学问题。上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）是指上皮样特性的细胞转变为间充质样特性细胞的过程,常伴随细胞形态改变,极性丧失,迁移和侵袭力增强,抵抗失巢凋亡和分泌大量细胞外基质。EMT在肿瘤转移中起关键作用,既可提高肿瘤细胞的运动能力和侵袭力,促进局部侵袭浸润,又能使肿瘤细胞获得干性特征,进而抵抗外界环境刺激,促进细胞生存和定植。EMT是一个动态的,可塑性过程,研究表明,表观遗传修饰可调控肿瘤细胞发生EMT,影响肿瘤的转移。随着近年来高通路测序技术的进步,RNA修饰,特别是RNA的N6-甲基腺苷（m~6A）修饰受到广泛关注,m~6A修饰在多种类型肿瘤的发生发展过程中起到复杂的调控作用。本研究希望通过构建肾癌细胞EMT模型,探讨m~6A修饰及其相关分子在肾癌细胞EMT以及肾癌转移中的作用及机制,为转移性肾癌的基础研究提供新的思路和理论依据,以期寻找到能早期预测并治疗转移性肾癌的新靶点。研究方法1.利用转化生长因子-β1（TGF-β1,10ng/m L）体外处理肾癌细胞786-O和OSRC2,构建肾癌EMT模型,并通过光镜观察细胞形态,Western Blot和q PCR检测肾癌细胞EMT的特征性标志物的表达变化情况,证明肾癌细胞发生EMT。2.构建肾癌细胞EMT模型后,通过划痕实验和侵袭实验,比较发生EMT后的肾癌迁移和侵袭能力的变化。3.发现肾癌细胞发生EMT,且迁移和侵袭能力明显增强后,收集发生EMT后的细胞与正常对照细胞,利用m~6A抗体进行m~6A免疫共沉淀测序,通过生物信息学分析,检测两组细胞m~6A修饰特征的差异性。同时对两组细胞进行m RNA测序,分析差异表达的m RNA。4.利用Western Blot和q PCR检测发生EMT后的肾癌细胞与对照组肾癌细胞中,m~6A修饰相关基因表达差异。5.确定YTHDF1为肾癌细胞发生EMT后,表达差异最显著的基因。探索TGF-β1诱导肾癌细胞YTHDF1表达升高的调控机制,在TGF-β1处理肾癌细胞的同时,通过si RNA分别特异性敲降TGF-β1信号通路的下游基因Smad2和Smad3,进行Western Blot和q PCR检测YTHDF1表达量的变化。6.利用si RNA分别特异性敲降肾癌细胞Smad2和Smad3,接着将YTHDF1的启动子序列克隆至PGL3质粒并转染入肾癌细胞,通过双荧光素酶报告基因实验,检测Smad2和Smad3对TGF-β1诱导的YTHDF1启动子活性的影响。7.发现Smad2的表达可显著影响TGF-β1诱导的YTHDF1启动子的活性后,设计特异性引物,利用TGF-β1处理肾癌细胞,进行Ch IP-q PCR实验,验证Smad2蛋白与YTHDF1启动子区域的结合。8.通过慢病毒系统敲降及过表达肾癌细胞YTHDF1,构建稳转细胞株,利用Western Blot确认敲降及过表达效率,并检测肾癌细胞中EMT相关标志物的表达变化。同时进行划痕和侵袭实验,检测YTHDF1的表达水平对肾癌细胞EMT以及迁移、侵袭能力的影响。同时利用Luc报告基因标记肾癌细胞,筛选稳转细胞株后,将细胞通过尾静脉注射入BALB/C裸鼠体内,构建小鼠肾癌肺转移模型,评估YTHDF1表达对肾癌肺转移的影响。9.利用蛋白质谱技术,检测敲低YTHDF1后,肾癌细胞内蛋白含量的表达变化,同时结合me RIP-seq数据以及查阅文献,筛选得到Rap1a可能为TGF-β1诱导肾癌细胞EMT过程中,YTHDF1发挥作用的潜在靶基因。10.TGF-β1处理肾癌细胞,使用m~6A抗体进行me RIP-q PCR实验,检测TGF-β1诱导肾癌细胞发生EMT的过程中,Rap1a m RNA的m~6A修饰水平的变化。另外,使用YTHDF1抗体进行RIP-q PCR,检测YTHDF1蛋白与Rap1a的m RNA的结合比例变化情况。11.利用TGF-β1处理肾癌细胞,或者在肾癌细胞中过表达YTHDF1,通过Western Blot检测对Rap1a蛋白表达的影响。在TGF-β1处理肾癌细胞的基础上敲降YTHDF1,观察对Rap1a蛋白表达的影响。12.发现TGF-β1诱导的肾癌细胞EMT过程中,Rap1a的m~6A修饰水平升高,且YTHDF1蛋白与Rap1a的结合比例增加。分别利于TGF-β1处理肾癌细胞,或者在肾癌细胞中过表达YTHDF1,通过核糖体-新生肽链复合物-实时荧光定量PCR（Ribosome Nascent-chain Complex-Quantitative Real-time PCR,RNC-q PCR）检测对Rap1a的蛋白翻译的影响。13.在肾癌细胞过表达YTHDF1的基础上敲降Rap1a,观察对肾癌细胞迁移侵袭能力的影响,通过Western Blot和q PCR观察对肾癌细胞EMT标志物表达的影响。研究结果1.成功构建并证实肾癌细胞786-O和OSRC2的EMT模型,形态学和标志性蛋白的变化情况符合EMT的特征。2.相对于对照组细胞,经过TGF-β1处理后发生EMT的肾癌细胞迁移和侵袭力明显提高。3.m RNA测序联合me RIP测序结果显示肾癌细胞786-O发生EMT后,与EMT相关的通路显著富集。4.肾癌细胞发生EMT后,YTHDF1的蛋白及m RNA表达明显升高。5.利用小干扰RNA敲降Smad2,而非敲降Smad3,可明显抑制TGF-β1诱导的肾癌细胞YTHDF1高表达。6.双荧光素酶报告基因实验显示TGF-β1刺激肾癌细胞后,能明显增强YTHDF1启动子活性,而使用小干扰RNA敲降Smad2,而非敲降Smad3,可明显抑制TGF-β1诱导的YTHDF1启动子区域的荧光素酶报告基因的活性。7.Ch IP-q PCR实验显示,TGF-β1刺激肾癌细胞后,Smad2蛋白可与YTHDF1启动子区域结合。8.敲降肾癌细胞的YTHDF1可抑制肾癌细胞EMT过程以及肾癌细胞的迁移和侵袭能力。过表达肾癌细胞的YTHDF1可促进肾癌细胞EMT并提高迁移和侵袭力。小鼠肾癌肺转移模型证实,敲低YTHDF1后可抑制肾癌的肺转移。9.蛋白质组学联合me RIP-seq筛选得到Rap1a可能为TGF-β1诱导肾癌细胞EMT过程中YTHDF1发挥作用的下游潜在靶基因。10.TGF-β1在诱导肾癌细胞发生EMT的过程中,Rap1a的m~6A修饰水平明显升高,同时Rap1a m RNA与YTHDF1蛋白结合的比例增多。11.肾癌细胞过表达YTHDF1或经过TGF-β1处理都可明显增强Rap1a的蛋白表达水平。当敲降肾癌细胞的YTHDF1时,TGF-β1无法增加Rap1a的蛋白表达。12.TGF-β1在诱导肾癌细胞发生EMT的过程中,Rap1a m RNA的翻译效率明显增加。过表达YTHDF1可明显促进Rap1a的蛋白翻译。13.过表达YTHDF1的同时将敲降Rap1a,可抑制YTHDF1介导的肾癌细胞的EMT和侵袭力.研究结论我们通过构建肾癌细胞EMT模型,发现肾癌细胞在EMT过程中恶性潜能升高,且m~6A修饰特征发生改变,其中YTHDF1的表达量明显升高。YTHDF1的表达影响肾癌细胞的EMT及侵袭转移能力。通过对调控YTHDF1的上游机制进行探讨,发现TGF-β1/Smad2信号轴可通过调控YTHDF1的转录进而促进其表达。对YTHDF1的下游靶点进行筛选发现,YTHDF1可结合发生m~6A修饰的Rap1a m RNA,并促进Rap1a的蛋白翻译,进而调控肾癌细胞EMT过程及迁移侵袭能力。