研究背景与目的椎间盘退变（intervertebral disc degeneration,IDD）是导致腰背痛的重要疾患,在中老年患者中具有较高发病率,并可导致严重的神经功能损害甚至残疾。伴随世界范围内人口老龄化的发展,IDD发病率越来越高,同时IDD也是影响人类健康的问题之一,给个人、家庭、和社会带来了巨大的经济负担。IDD治疗方式包括保守治疗和手术治疗,尽管手术治疗能彻底去除病变组织并缓解症状,但手术治疗附带的经济负担、生活不便以及远期再发均会严重影响术手术治疗的远期效果。因此,找到有效的延缓椎间盘退变的非手术治疗方式及靶点,一直是椎间盘退变研究领域的焦点问题。IDD的病因纷繁复杂,然而没有任何一种因素被认为是导致椎间盘退变的直接病因。研究报道,骨赘严重程度与椎间隙高度间具有显著相关性,而椎间隙高度减低又是椎间盘退变的重要表现。在重度退变的椎间盘退变的患者影像学资料上也常常可见连续、坚固的骨赘形成。那么,骨赘形成在IDD中扮演什么角色同时,目前缺乏研究。近年来的研究发现,椎体骨代谢的异常与椎间盘退变存在相关性,其中骨化相关基因在IDD发病中发挥重要作用,例如,BMP2作为成骨关键基因,其表达水平与IDD的严重程度存在显著相关性。又如,成骨关键转录因子Runx2,能够通过激活髓核细胞内β-catenin积累促进IDD进展。成骨细胞介导的骨赘形成,同时也贯穿骨重塑的整个周期,不仅确保骨骼的多种功能,也与人体众多系统,如神经系统、内分泌系统间有着信息调控。成骨细胞参与IDD的调控也越来越引起研究者的关注。在椎间盘中,瘦素通过激活MAPK/ERK信号通路促进终板软骨细胞成骨分化,进而导致髓核营养缺失促进IDD进展。研究发现,p27-/-小鼠中p27基因缺失可激活shh信号通路,促进成骨分化,引起IDD恶化。但是,成骨细胞参与调控IDD的关键机制仍不明确。外泌体是细胞所释放的直径在30-150nm脂质双层球状纳米囊泡,其中含有核酸、蛋白质、脂质等物质。外泌体通过传递如mi RNA等信号分子,进行细胞间信号调控,参与调节多种疾病发病。目前也有研究发现,外泌体在调控椎间盘退变的发生发展过程中扮演了重要的角色。例如,已发生退变的髓核细胞分泌的外泌体会激活健康髓核细胞中的炎症相关通路,加速细胞外基质降解,促进IDD发展。那么,外泌体是否介导成骨细胞与髓核细胞间的信号沟通,进而调控IDD发病?基于上述内容,本课题拟通过临床资料研究椎体骨赘与椎间盘退变相关性,进而通过高通量测序研究研究成骨细胞外泌体调控髓核细胞退变的调控因子与下游靶点,并在细胞和动物水平进行验证。第一部分成骨细胞诱导椎间盘退变的研究方法:收集临床椎间盘退变的三维CT和MRI资料,进行椎体骨赘Nathan分级与椎间盘退变Pfirrmann分级,并对评分结果进行回归分析,研究椎体骨赘与椎间盘退变的相关性;于大鼠椎体处注射BMP2,构建大鼠椎体骨赘模型,通过micro-CT检测椎体骨赘程度,通过MRI和组织学染色评估椎间盘退变程度,研究椎体骨赘对椎间盘退变的调控作用;成骨细胞和髓核细胞共培养,PCR检测髓核细胞细胞外基质合成分解情况,明确成骨细胞在髓核细胞退变的作用。结果:共收集椎间盘退变临床资料120例,其中Pfirrmann分级I级8例子,II级12例,III级28,IV级44例,V级28例,对Pfirrmann分级和Nathan分级进行相关性,椎间盘退变Pfirrmann分级与椎体骨赘Nathan分级spearman’s相关性分析的R值为0.717（p＜0.05）,Kendall’s Tau相关分析的R值0.799（p＜0.05）,椎体骨赘程度与椎间盘退变相关性显著;micro-CT显示,椎体近终板处注射BMP2的大鼠可见明显骨赘形成,椎体骨赘显著,而组织学染色结果显示椎间盘结构紊乱,细胞外基质成分丢失,组织学椎间盘退变评分增高,退变显著。说明椎体骨赘可诱导IDD;成骨细胞与髓核细胞共培养后,PCR检测显示,collagen II、aggrecan表达减少,MMP3、MMP13表达增加。结论:相关性分析提示,椎体骨赘程度与椎间盘退变相关性显著;通过椎体注射BMP2,成功构建大鼠椎体骨赘模型,椎体骨赘模型的大鼠上出现椎间盘退变,说明椎体骨赘可诱导椎间盘退变;成骨细胞可诱导髓核细胞细胞外基质降解,促进髓核细胞退变。第二部分:成骨细胞外泌体中mi R-499b-5P是调节椎间盘退变的关键因子方法:使用差速离心法提取成骨细胞外泌体,通过透射电镜、外泌体粒径检测、蛋白免疫印迹（Western blot,WB）对成骨细胞外泌体进行鉴定;使用提取的成骨细胞外泌体干预髓核细胞,通过PCR检测髓核细胞细胞外基质合成和降解情况;于大鼠椎体处注射成骨细胞外泌体,通过MRI和组织学染色检测大鼠椎间盘退变情况,研究在动物水平,成骨细胞外泌体对椎间盘退变的调控;对成骨细胞外泌体进行高通量测序,通过生物信息学分析筛选出差异基因;对成骨细胞外泌体诱导的髓核细胞进行高通量测序,明确成骨细胞外泌体干预后,髓核细胞内转录组表达和通路激活情况;通过对差异基因进行沉默和过表达,明确其功能。结果:透射电镜下可观察到囊泡结构的外泌体颗粒;外泌体颗粒的直径以108.3nm与141.9nm为主,其中直接141.9nm的外泌体颗粒含量最多,为2.6E+5,占总外泌体颗粒的59.7%;WB显示提取颗粒TSG101、CD63、CD9抗原为强阳性,与成骨细胞特征性抗原一致,提示其为成骨细胞外泌体;PCR显示成骨细胞来源外泌体处理髓核细胞后,髓核细胞Collgan II、Aggrecan表达减少,MMP3、MMP13表达增加;椎体近终板处注射成骨细胞外泌体,MRI显示椎间盘信号降低,组织学染色显示椎间盘结构紊乱,细胞外基质成分丢失;成骨细胞外泌体高通量测序显示,在聚类分析中mi RNA差异性表达显著,其中mi R-499b-5p、mi R-93-5p表达最为显著;mi R-499b-5p过表达后,Collgan II、Aggrecan表达减少,MMP3、MMP13表达增加;mi R-499b-5p干扰后,Collgan II、Aggrecan表达显著增加,MMP3、MMP13表达显著减少;而mi R-93-5p干扰和过表达后,Collagen II、Aggrecan、MMP3、MMP13则无显著变化;在大鼠椎间盘穿刺模型中,MRI显示mi R-499b-5p过表达组中,髓核内信号进一步降低,mi R-499b-5p沉默组中,髓核内信号恢复;高通量测序显示,成骨细胞来源外泌体处理髓核细胞后,聚类分析显示转录组显著差异性表达,差异基因在NF-κB信号通路等与IDD发病相关的信号通路显著富集。结论:成功分离成骨细胞细胞外泌体;成骨细胞外泌体在细胞水平和动物水平诱导髓核细胞细胞外基质降解,促进IDD;mi R-499b-5p是成骨细胞外泌体调控椎间盘退变的关键因子;细胞和动物水平过表达、沉默mi R-499b-5p可调节髓核细胞退变;高通量测序提示,成骨细胞来源外泌体处理髓核细胞后,髓核细胞退变相关通路激活。第三部分成骨细胞外泌体通过TWIST1/IL-6轴调控椎间盘退变方法:对椎间盘退变的临床标本进行高通量测序,研究椎间盘退变过程中的差异基因;IHC和PCR验证骨化相关基因在椎间盘退变的临床标本中的差异性表达;结合成骨细胞外泌体干预下髓核细胞中差异表达的基因、Targetscan预测mi R-499b-5p下游靶点基因以及临床标本筛选的骨化相关基因,筛选mi R-499b-5p调控髓核细胞退变的下游靶点;在髓核细胞内进行mi R-499b-5p的过表达和沉默,通过PCR、WB检测TWIST1的表达;沉默、过表达TWIST1,PCR、WB检测髓核细胞退变;高通量测序检测TWIST1沉默后髓核细胞内差异表达基因和富集通路;CHIP验证TWIST1下游靶点。结果:聚类分析发现,椎间盘退变的样本中,m RNA显著差异性表达,GO生物学功能分析发现,IDD中骨化相关基因发生明显上调,成骨抑制性基因发生明显下调,蛋白互作网络分析发现,IDD中骨化基因相关簇明显差异性表达;IHC、PCR检测显示椎间盘退变的临床标本中各骨化相关基因出现差异性表达,其中,骨化促进基因BMP2、Runx2、POSTN、IBSP表达上调,骨化抑制基因ID2、TWIST1、TWSIT2均出现下调;通过Targetscan预测mi R-499b-5p下游靶点,共预测下游靶点4888个,结合成骨细胞外泌体干预下髓核细胞中差异表达的基因、骨化相关基因分析,筛选出mi R-499b-5p调控髓核细胞退变的下游靶点为TWIST1;mi R-499b-5p过表达后,TWIST1显著降低,而mi R-499b-5p沉默后,TWIST1显著升高;双荧光素报告酶实验验证TWIST1为mi R-499b-5p下游靶点;TWSIT1基因过表达后,Aggrecan、Collagen II、CHSY1基因表达显著上调,MMP1、MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5表达显著下降;TWSIT1基因沉默后,Aggrecan、Collagen II、CHSY1基因表达显著下调,MMP1、MMP3、ADAMTS4、ADAMTS5表达显著上调;聚类分析显示,TWIST1沉默后髓核细胞转录组表达出现显著差异,MAPK通路、NF-KB通路等椎间盘退变相关通路显著富集;CHIP实验显示IL-6为TWIST1调控椎间盘退变下游通路。结论:骨化相关基因在椎间盘退变中显著差异性表达,提示骨化基因在椎间盘退变中扮演重要角色;mi R-499b-5p调控髓核细胞退变的下游靶点为TWIST1;TWIST1调控髓核细胞细胞外基质合成和降解,调控髓核细胞退变;IL-6为TWIST1调控椎间盘退变的下游通路。