【摘 要】
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目的:卵巢癌细胞化疗耐药是影响治疗效果和预后的重要原因。拟通过对肿瘤耐药相关基因YWHAZ的研究,验证其在卵巢癌中与上游非编码RNA的调控机制,并验证该调控机制在卵巢癌细胞产生耐药的过程中发挥的作用。方法:利用TCGA、GEO、GEPIA数据库和在线工具软件star Base、circ Bank预测YWHAZ的上游调控基因;q RT-PCR检测预测基因表达筛选适合的实验细胞株;DDP梯度浓度培养法
【基金项目】
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新疆维吾尔自治区科技厅自然科学基金面上项目（circ＿C20orf11调控YWHAZ基因参与卵巢癌细胞铂耐药的机制研究）,项目编号:2021D01C403,起止日期:2021年06月01日至2024年05月31日；
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目的:卵巢癌细胞化疗耐药是影响治疗效果和预后的重要原因。拟通过对肿瘤耐药相关基因YWHAZ的研究,验证其在卵巢癌中与上游非编码RNA的调控机制,并验证该调控机制在卵巢癌细胞产生耐药的过程中发挥的作用。方法:利用TCGA、GEO、GEPIA数据库和在线工具软件star Base、circ Bank预测YWHAZ的上游调控基因;q RT-PCR检测预测基因表达筛选适合的实验细胞株;DDP梯度浓度培养法（0.625、1.25、2.5、5、10、20μM）培养耐药细胞株,并用MTT法计算细胞IC50;双荧光素酶实验验证靶基因之间的靶向结合能力;利用RNA干扰技术在细胞中沉默circ＿C20orf11、mi R-527并稳定培养;q RT-PCR检测不同条件下YWHAZ、mi R-527、mi R-423-5p和circ＿C20orf11表达水平;Western Blot方法检测细胞外囊泡标记蛋白CD9、CD63和TSG101,肿瘤细胞膜蛋白YWHAZ和PD-L1的表达;细胞克隆实验检测细胞的增殖能力,流式细胞仪检测细胞凋亡;透射电镜和纳米颗粒追踪仪鉴定细胞培养上清液和人源血清中的EVs的形态和粒径;用PMS诱导THP-1细胞后与EVs共培养,ELISA检测细胞因子IL-6、IL-10数量;激光扫描显微镜检测DAPI染色的EVs细胞内定位;q RT-PCR检测巨噬细胞相关细胞因子TNF-α、i NOS、CD206、IL-6、IL-10和Arg-1的表达;构建裸鼠移植瘤模型检测circ＿C20orf11体内对卵巢肿瘤生长和肿瘤微环境的影响。结果:1)在卵巢正常细胞和卵巢上皮恶性肿瘤细胞中,mi R-527、mi R-423-5p和circ＿C20orf11表达水平具有显著差异。其中circ＿C20orf11表达水平在卵巢癌细胞系SKOV3、A2780与对照用卵巢正常上皮细胞差异倍数最高（P＜0.001）;在耐药细胞SKOV3/DDP、A2780/DDP表达水平有显著差异（P＜0.01）,耐药细胞中circ＿C20orf11表达明显高于卵巢癌细胞;2)相同浓度DDP处理的SKOV3细胞与SKOV3/DDP细胞、A2780细胞与A2780/DDP细胞的IC50值具有显著差异（P＜0.01）,耐药细胞的IC50值是敏感细胞的2倍以上;3)沉默circ＿C20orf11后的SKOV3/DDP细胞和A2780/DDP细胞予以DDP处理,IC50值较沉默前显著下降,细胞克隆数量显著下降,细胞凋亡显著增加,circ＿C20orf11与mi R-527/mi R-423-5p具有靶向结合位点,mi R-527/mi R-423-5p与YWHAZ具有靶向结合位点,转染mi R-527-inhibitor能够逆转沉默circ＿C20orf11后的细胞功能变化,可观察到细胞克隆数量显著增加,细胞凋亡显著减少;4)在耐药细胞中沉默circ＿C20orf11,YWHAZ和PD-L1的表达均显著下降（P＜0.01）,转染mi R-527-inhibitor后,YWHAZ和PD-L1的表达均显著恢复（P＜0.05）。裸鼠成瘤实验显示沉默circ＿C20orf11移植瘤体积缩小和重量减轻,mi R-527的表达显著增加（P＜0.01）,YWHAZ和PD-L1的表达均显著减少（P＜0.01）;5)细胞上清液中分离出EVs的平均直径为100nm,人源血清中分离出的EVs平均直径为160nm,两者特异性标记物CD9,CD63和TSG101均表达,并且耐药患者血清EVs中circ＿C20orf11表达水平较非耐药患者血清EVs中circ＿C20orf11表达显著增加（P＜0.01）。EVs与巨噬细胞共培养后,EVs能够被巨噬细胞吸收,并且低表达circ＿C20orf11的EVs诱导巨噬细胞分泌更多的IL-6,同时IL-10的分泌减少;沉默circ＿C20orf11细胞的EVs能够诱导巨噬细胞TNF-α、IL-6和i NOS表达明显增加（P＜0.01）,M1型极化增加,CD206、IL-10和Arg-1的表达减少（P＜0.05）,M2型极化减少。结论:在卵巢癌中circ＿C20orf11是促癌基因,1)通过mi R-527/mi R-423-5p靶向调控YWHAZ参与细胞增殖和细胞凋亡,从而提高卵巢癌细胞对DDP的耐受能力;2)在肿瘤微环境中通过EVs诱导巨噬细胞M2型极化参与免疫调节,促进肿瘤进展和耐药。上述两项可能是circ＿C20orf11调控卵巢癌DDP耐药的可能机制。
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