LncRNA在桥本甲状腺炎中的差异表达及生物学功能研究

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背景:桥本甲状腺炎(Hashimoto thyroiditis,HT)属于一类器官特异性免疫疾病,其发生较为广泛,发生群体以女性为主,特征表现为循环自身抗体。HT通过淋巴细胞(包括CD4+和CD8+T细胞)诱导慢性甲状腺炎症和甲状腺组织浸润。在HT中,抗甲状腺免疫反应开始于甲状腺抗原特异性辅助T细胞的激活。抗原暴露后CD4+T细胞被激活、增殖和分化。基于细胞因子信号分化方面的区别,可将CD4+T细胞进行T细胞亚型的划分,含辅助性T细胞或效应T细胞谱系,包括Th1、Th2、Th17细胞,或Treg细胞。若Th1与Th17细胞被活化,它们就会诱导B细胞分泌甲状腺抗体,从而促进自身免疫反应。此外,Treg细胞对炎症与免疫具抑制效应。研究表明,HT病人Th1与Th17亚群增多,过表达IFN-G与IL-17A。长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)属于非蛋白质编码RNA,其自身长度大于200个碱基对。人类与动物体内此类RNA的分布很广,在转录调节、细胞功能和许多疾病(包括癌症)的反义转录中发挥多种生物学作用。Lnc RNA同诸多癌症过程皆有关,如增殖、凋亡、干细胞分化、转移和治疗耐药性。Lnc RNA的其中一项潜在机制即,其能够作为竞争性内源性RNA(ce RNA)结合mi RNA,从而对靶基因施以保护。在本研究中,我们旨在筛选与HT的进展和病理阶段相关的Lnc RNA,同时探究T细胞中Lnc RNA的生物学活性,更为深入地分析Lnc RNA释放活性的分子生物学机制。在本研究中,我们发现NONHSAT135873.2可以影响T细胞的增殖,凋亡,迁移,分化等功能,以及影响相应的分子靶点,并且通过竞争性结合mi R-1587调控IL17A的分泌而在HT中发挥促炎作用,最后又研究了mi R-1587在T细胞系中的生物学功能。NONHSAT135873.2为挖掘HT新的作用靶点给予了实验支撑。研究方法:1.收集2018年9月-2019年5月就诊于中国医科大学附属第一医院内分泌与代谢病科37例HT患者与50例健康人的外周血,记录相关的临床病理资料,样本行CD4+T细胞磁珠分选,用于转录组测序。此外,另收集40例HT患者与50例健康人的外周血,用于对测序结果的验证。2.利用QRT-PCR检测研究对象CD4+T细胞中NONHSAT135873.2的表达,分析NONHSAT135873.2的表达量与临床病理资料的关系。3.在T细胞系中使用核质分离提取RNA的方法对NONHSAT135873.2进行定位。4.通过转染si RNA改变Jurkat细胞系内NONHSAT135873.2的表达量,使用QRT-PCR检测干扰效率。利用CCK8、Edu实验检测NONHSAT135873.2对T细胞增殖的影响,借助流式细胞术(FCM)对NONHSAT135873.2影响T细胞凋亡的状况展开测定,借助transwell实验对细胞迁移展开测定,借助Western或QRT-PCR测定PCNA、MMP9、AKT、MMP2、Ki67、Bcl-xl、Bad与Bcl-2的表达,QRT-PCR检测T细胞亚型或分化的相关分子:QRT-PCR和ELISA实验检测炎症因子IL17A.IFNG的表达。5.利用生物信息学数据库预测能同时和NONHSAT135873.2,IL17A结合的mi RNA。6.沉默NONHSAT135873.2,随后QRT-PCR验证生物信息学分析得到的mi RNA。7.干扰或过表达mi R-1587,检测转染效率。8.利用QRT-PCR,ELISA实验检测mi R-1587对IL17A表达量的调控。9.共转染NONHSAT135873.2,mi R-1587,然后检测IL17A的表达。10.双萤光素酶报告基因实验验证mi R-1587能否与NONHSAT135873.2和IL17A直接结合。11.借助CCK8与Edu实验对mi R-1587影响T细胞增殖的状况展开测定,借助FCM对mi R-1587影响T细胞凋亡的状况展开测定,借助transwell实验对细胞迁移展开测定,QRT-PCR或Western检测PCNA,MMP2,Ki67,Bcl-xl,AKT,Bcl-2,Bad,MMP9的表达,QRT-PCR检测T细胞亚型分子FOXP3,RORγT,STAT3,T-bet的表达,QRT-PCR和ELISA实验检测炎症因子IL17A.IFNG的表达。结果:1.NONHSAT135873.2于HT病人的CD4+T细胞内的表达大幅上调,并与TPOAb呈正相关。2.NONHSAT135873.2存在于细胞质和细胞核中,细胞质中含量更多。3.NONHSAT135873.2在体外实验中可以促进T细胞增殖,抑制凋亡,促进细胞迁移,调控细胞分化。4.沉默NONHSAT135873.2后,PCNA,AKT,Ki67,Bad,Bcl-2,Bcl-xl,MMP9与MMP2的表达下调,RORγT,FOXP3,STAT3,T-bet的表达也明显下调。5.在Jurkat细胞系中沉默NONHSAT135873.2后能够显著下调IL17A,IFNG的表达水平。6.在T细胞中沉默NONHSAT135873.2的表达能够提高mi R-1587的m RNA水平。7.mi R-1587能够调控IL17A的表达。8.mi R-1587可以调控T细胞增殖,凋亡,迁移和细胞分化。9.mi R-1587通过调控AKT,Ki67,Bad,Bcl-2,Bcl-xl,MMP2,MMP9的表达影响增殖,凋亡,迁移,同时也影响T细胞亚型分子FOXP3,RORγT,STAT3,T-bet的表达。10.双萤光素酶报告基因实验证明mi R-1587可以与NONHSAT135873.2,IL17A直接结合。11.NONHSAT135873.2可以通过竞争性结合mi R-1587调控IL17A表达量。结论:NONHSAT135873.2于HT病人CD4+T细胞内的表达大幅上调,且正向相关于TPOAb。NONHSAT135873.2在HT中通过竞争性结合mi R-1587调控IL17A的表达,同时对T细胞增殖、迁移、凋亡与分化施以调控,发挥生物学功能,是HT潜在生物标志物与作用靶标。
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