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目的:胆石病（gallstone disease,GD）系肝胆外科常见病、多发病。在国内随着生活方式的改变,GD的发病率逐渐增加,尤其是50岁以上的人群。随着胆囊结石的形成,并发GD可导致致命性胆管炎和急性胰腺炎等严重并发症。GD危险因素可分为环境风险因素、人口风险因素和遗传风险因素等。然而,已报道大多数危险因素在不同国家和地区的人群中有所不同。长非编RNA（lnc RNAs）是长约200个核苷酸的非编码RNA。RNA聚合酶II参与了大多数已知的lnc RNAs的转录。这些高度保守且广泛存在的转录本在许多疾病中发挥着重要的生物学调节作用。然而,lnc RNAs与胆囊癌癌前病变至胆囊原位癌演变过程及胆石病的相关性在国内外还未见报道。经查阅并分析相关的胆石症风险因素相关文献,筛选并检测以下可能与胆石症相关的lnc RNAs:包括H19（H19 Imprinted Maternally Expressed Transcript）、MEG3（Maternally Expressed 3）、GAS5（Growth Arrest Specific 5）、uc.333、NEAT1（Nuclear Paraspeckle Transcript 1）和MALAT1（Metastasis Associated Lung Adenocarcinoma Transcript 1）。对比分析了GD患者和健康对照者血清中上述候选lnc RNAs差异表达;利用GEO和TCGA RNA测序数据及STARBASE数据库,对MALAT1下游靶基因进行预测并验证。并利用生物信息学对MALAT1及其下游靶基因在肿瘤中的功能进行相关分析;同时验证分析胆囊增生组织与胆囊原位癌组织MALAT1及其下游靶基因m RNA表达水平及两者相关性;在细胞层面验证分析MALAT1及其下游靶基因对胆囊癌细胞增殖和侵袭的影响。旨在明确和验证胆石症形成的危险因素与MALAT1的关系;阐述MALAT1及调控的靶基因与胆囊粘膜上皮增生至胆囊癌演变过程的相关性及其生物学意义。旨在从lnc RNA MALAT1角度进一步探究胆石病与胆囊癌发生的相关性以及对胆囊癌生物学行为的影响。研究方法:1、病例收集和资料分析:选取了2008年1月至2018年7月广东省东莞市南城医院3202名年龄和性别相匹配的合格参与者组成研究人群。将人群分为GD组（有胆结石患者,N=1134）和健康对照组（N=2068）。同时收集具有完整临床数据的病理诊断为胆囊粘膜上皮增生、不典型增生和胆囊原位癌257例组织标本。人口统计信息包括年龄、性别、种族、职业和教育程度。临床数据包括家族遗传、酒精暴露、吸烟暴露、体力活动、体重指数（BMI）、舒张压、收缩压、丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。2、lnc RNAs检测与分析:应用定量聚合酶链反应（Quantitative polymerase chain reaction,q PCR）检测lnc RNA H19、MEG3、GAS5、uc.333、NEAT1和MALAT1在GD组和健康对照组的表达水平。通过Logistic回归模型估计GD与危险因素之间的相关性。通过检测MALAT1在胆囊粘膜上皮增生至癌变演变过程中不同阶段相关病例对应血清样本MALAT1表达水平,通过受试者操作特征（Receiver operating characteristic,ROC）曲线确定诊断值。3、生物信息学分析:利用R语言,分析GD患者胆囊病理组织m RNA转录组数据。从GEO数据库下载胆囊RNA-seq数据集,数据号:GSE152419。利用STARBASE数据库进行lnc RNA下游的蛋白编码基因（protein coding gene）的预测,并结合上述数据库的差异分析结果取其交集,获得相应下游可能的蛋白编码基因。利用TCGA数据库用于后续预测的lnc RNA下游的蛋白编码基因的功能和相关分析,主要进行的分析包括:差异分析,GSEA富集分析,KEGG分析等。4、利用慢病毒构建MALAT1干扰载体（sh-MALAT）,构建KPNA2基因干扰质粒（sh-KPNA2）以及过表达质粒（KPNA2-OE）。q PCR检测转染效率;Western blot检测蛋白表达;CCK-8法检测细胞增殖改变,Transwell小室检测细胞的迁移和侵袭能力。结果:1、GD形成高危因素分析:多因素Logistic回归分析:BMI、TG、HDLC是GD形成的高危因素,中高强度体力活动是保护性因素。2、GD形成与血清lnc RNA H19、MEG3、GAS5、uc.333、NEAT1和MALAT1表达相关性:MALAT1与GD具有显著相关性,而lnc RNA H19、MEG3、GAS5、uc.333、NEAT1与GD相关性不明显。联合分析显示,MALAT1的高表达是GD的独立危险因素,MALAT1高表达和低HDL-C在GD间存在显著的交互乘积作用。3、胆囊粘膜上皮增生、不典型增生或原位癌病例患者血清中MALAT1表达:与胆囊粘膜上皮单纯性增生相比,II级或III级非典型增生或原位癌患者的MALAT1显著升高。I级不典型增生与上皮单纯增生患者之间无显著差异。随着粘膜增生病理病变程度加重,MALAT1的表达量逐渐增高,在原位癌组织中MALAT1表达量最高,说明MALAT1与胆囊上皮不典型增生至癌变演变病理过程明显相关。4、利用胆囊病理组织m RNA转录组数据进行GSEA富集分析,GD差异基因主要富集在脂代谢与细胞增殖相关通路;STARBASE预测结合组织样本验证KPNA2（Karyopherin Subunit Alpha 2）可能是MALAT1下游靶基因。5、利用GEO数据集GSE152419进行KPNA家族基因与脂质代谢、细胞周期相关基因表达相关性分析,KPNA家族基因与LPIN1、ACSL4等脂质代谢相关基因及MYC、TGFB2等细胞增殖相关基因表达水平具有显著相关性。6、利用TCGA数据库33种实体肿瘤RNA测序数据,分别作KPNA2与脂质代谢、细胞周期、肿瘤分期及功能富集泛癌分析,KPNA2与FASN、ACLY、FADS1等多个调节脂质代谢基因表达具有显著相关性;KPNA2与CDC45、CDC7、CDC6等调节细胞周期相关基因表达亦具有显著相关性;KPNA2在不同恶性肿瘤分期中表达具有显著差异;KPNA2主要富集在MYC TARGET V1、E2F TARGET以及G2M CHECKPOINT等细胞增殖相关基因集及MTOR1信号通路等。7、敲减胆囊癌细胞（GBC-SD）MALAT1,发现KPNA2蛋白表达下降,细胞增殖、迁移及侵袭能力降低;沉默KPNA2,胆囊癌细胞增殖、迁移及侵袭能力降低;回复实验提示过表达KPNA2,可部分逆转因敲减MALAT1所致的胆囊癌细胞增殖、迁移和侵袭能力的变化。结论:1、首次明确MALAT1是GD发生的独立危险因素,MALAT1高表达和低HDL-C与GD发生具有交互乘积作用;2、胆囊单纯增生与粘膜不典型增生以及原位癌不同粘膜病变阶段患者血清中MALAT1表达水平呈逐渐增高趋势;重度不典型增生和原位癌血清MALAT1表达显著增高;3、在胆囊原位癌组织中MALAT1与KPNA2表达水平呈显著正相关。生信分析预测两者有相互结合序列,并发挥相互作用。4、生物信息学分析表明,MALAT1靶基因KPNA2,参与脂质代谢和细胞增殖调控。5、首次证实在胆囊癌细胞系MALAT1正向调控KPNA2表达,促进胆囊癌细胞的增殖、迁移和侵袭。上述研究结果从lnc RNAs维度诠释GD与胆囊癌发生相互关系,为胆囊癌和胆石症的防治提供了重要的生物学信息。MALAT1是胆囊癌癌前病变和早期胆囊癌潜在的血清生物学标志物。