目的:甲状腺激素（thyriod hormone,TH）对大脑发育过程中的大量基因有调节作用,影响多种神经细胞类型的增殖、迁移和分化,并最终对成人的中枢神经系统功能产生深远的影响。妊娠期间的内分泌紊乱与反复流产、宫内生长受限、早产、心血管和神经异常有关。母体的甲状腺激素可通过胎盘进入胎儿血液循环,由于妊娠12周以前胎儿的甲状腺功能还未建立,在此期间胎儿的甲状腺激素全部依赖于母体供给。从妊娠12周起,胎儿可以分泌甲状腺激素,但母体甲状腺激素仍是胎儿脑发育的重要来源。因此母体甲状腺功能是否正常,在胎儿脑发育中起着至关重要的作用。甲状腺毒症是由于甲状腺激素分泌过多而导致的疾病,妊娠期由于雌激素水平增高及母体胎盘人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin,h CG）水平增加等因素的影响,会导致血总甲状腺素（total thyroxine,TT4）浓度从妊娠6~8周后逐渐增加。妊娠期甲状腺毒症的患病率在0.1%~1%之间。母亲的高游离甲状腺素（free thyroxine,FT4）浓度与较低的儿童智商相关,在成年后患神经和精神疾病的风险增加。然而妊娠期甲状腺毒症是否能够引起后代智力及神经和精神改变的机制研究相对较少。KLF9作为甲状腺激素直接调控的转录因子,在脑组织神经元中均有表达,但在发育中的海马、小脑的表达最高,在神经元的增殖、分化、轴突及树突的生长等方面起重要作用。海马是调节认知、情绪反应和行为功能的重要脑区,对动物的学习记忆有着重要的作用,胚胎期母体的内分泌环境改变可影响海马神经元结构和功能的完善,从而导致出生后脑功能受损。鉴于上述研究现状,本实验建立不同程度妊娠期甲状腺毒症模型,通过三种行为学实验,旷场实验（open field test,OF）,高架十字迷宫（elevated plus maze test,EPM）及Morris水迷宫（morris water maz,MWM）检测母体甲状腺毒症大鼠后代的自发性探索行为、焦虑程度和空间学习记忆能力。通过动物实验从形态学、蛋白水平来探索母体甲状腺毒症对后代脑发育的影响及其机制。并通过细胞学进一步验证过量甲状腺素是否可以影响海马发育,参与后代记忆障碍的病理生理过程,为深入揭示母体甲状腺毒症引起后代脑发育异常的发病机制提供依据。研究方法:第一部分:1.选择45只8周龄的Wistar雌性大鼠,适应性喂养2周后,随机分为3组,将给予左旋甲状腺素（L-T4）10μg/100g皮下注射组为H1组（n=15）,L-T4 20μg/100g皮下注射组为H2组（n=15）和0.9%生理盐水皮下注射组为对照组（n=15）,自妊娠起至分娩每日给药。2.在妊娠结束时每组6只母鼠行眶后采血以进行激素检测。放免法测定母鼠血清中总甲状腺素（TT4）和促甲状腺激素（TSH）含量,验证母鼠模型建立情况。3.分别于PND（postnatal day）10和PND40每组各处死6只仔鼠,放免法检测仔鼠TT4和TSH含量。4.仔鼠PND40开始依次进行旷场、高架十字迷宫及水迷宫实验,检测后代焦虑倾向和空间学习记忆能力。5.仔鼠PND40时应用尼氏染色法,观察各组大鼠海马组织CA1区形态学变化。6.应用免疫组织化学法,观察各组仔鼠海马BDNF、KLF9、PSD95的表达变化。7.应用Western blot方法检测各组仔鼠海马KLF9、PSD95、BDNF、Trk B、p ERK1/2、ERK1/2蛋白及Wnt通路APC2/GSK3β/β-catenin的蛋白表达变化。第二部分:1.选用海马神经细胞系HT22进行体外研究。给予不同浓度T4处理HT22细胞24小时,通过CCK8实验检测细胞增殖能力,应用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期。2.用Western blot方法检测不同浓度T4处理HT22细胞24小时后,BDNF、Trk B、MEK、p ERK1/2、ERK1/2、PSD95、KLF9、APC2、GSK-3β及β-catenin的蛋白表达变化。3.300u M T4刺激HT22细胞的同时,分别加入ERK通路的特异性抑制剂U0126及β-catenin的激动剂CHIR99021作用24小时。通过Western blot检测ERK通路及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达变化,并通过流式细胞技术检测ERK通路及Wnt/β-catenin通路对细胞周期的影响。4.给予si RNA-KLF9敲除的HT22细胞株300u M T4刺激24小时,用Western blot方法检测APC2、GSK-3β、β-catenin及Cyclin D1的蛋白的表达变化,用流式细胞技术检测细胞周期情况。5.采用双荧光酶报告基因实验来验证KLF9是否可以作用于APC2的启动子区域。结果:第一部分:1、各组母鼠左旋甲状腺素（L-T4）给药后,于分娩时检测血清中TT4、TSH水平,H1组和H2组与正常对照组相比TT4显著升高（P?0.001）,TSH显著降低（P?0.05,P?0.001）。2、母鼠分娩当天体重,H1组及H2组的母鼠体重较正常对照组降低,但无统计学差异（P＞0.05）。3、H1组和H2组母鼠分娩后代出生体重较正常对照组显著降低,差异有统计学意义（P?0.001）。与正常组相比,H1组和H2组的仔鼠数量无统计学差异（P＞0.05）。4、两组实验组仔鼠在PND10及PND40时,血清中TT4及TSH水平与正常对照组比较无差异（P＞0.05）。5、旷场实验结果显示:H1组和H2组仔鼠与正常对照组相比,总行走距离及中心区行走距离、穿越中心格子数及进入中心区域的次数与中心区域运动距离的百分比均无明显统计学意义（P＞0.05）。6、高架十字迷宫结果显示,H1组和H2组在开臂停留时间、进入开臂次数与正常对照组相比均无统计学意义（P＞0.05）。7、水迷宫实验中各组后代游泳速度、总游泳距离和穿越平台所在象限次数无明显差异（P＞0.05）。在定位航行的第二天和第三天,H1组和H2组逃避潜伏期延长（P＜0.05,P＜0.01）,第四天H2组逃避潜伏期延长（P＜0.05）。8、各组仔鼠海马形态学变化:H1组CA1区锥体细胞内尼氏体积分光密度与正常对照组相比无明显统计学意义（P＞0.05）,H2组CA1区锥体细胞内尼氏体积分光密度较正常对照组降低（P＜0.05）。9、免疫组化检测结果显示,在产后40日龄,H1组和H2组BDNF及PSD95蛋白表达水平与正常对照组相比无明显统计学意义（P＞0.05）。H1组和H2组KLF9蛋白表达水平均显著高于正常对照组（P?0.05）。10、Western blot结果显示:PND40时,海马组织H1组和H2组KLF9及p Erk1/2蛋白表达量明显高于正常对照组（P?0.01）。H1组和H2组BDNF、Trk B和Erk1/2的蛋白表达未发生显著变化（P＞0.05）。H1组和H2组APC2、GSK-3β蛋白水平明显高于正常对照组（P?0.01）。H1组和H2组β-catenin蛋白水平明显低于正常对照组（P?0.05,P?0.01）。第二部分:1、梯度浓度T4刺激对HT22的细胞增殖有明显的抑制作用（P?0.05）,细胞凋亡并未发生显著变化（P＞0.05）。与正常对照组相比,T4处理的HT22细胞G0/G1期细胞比例升高,细胞周期阻滞,差异有统计学意义（P?0.01）。2、梯度浓度T4刺激HT22细胞,与正常对照组相比,BDNF、Trk B、MEK、ERK1/2、PSD95的蛋白表达水平未发生显著变化,无统计学差异（P＞0.05）;KLF9、p ERK1/2、APC2及GSK-3β的蛋白表达水平呈剂量依赖性增高,差异有统计学意义（P?0.05）;β-catenin蛋白表达水平降低,有统计学差异（P?0.05）。3、T4处理HT22细胞的同时分别加入U0126和CHIR99021。Western blot结果表明,与对照组相比,U0126使p ERK1/2蛋白表达降低（P?0.05）,KLF9、MEK及ERK1/2蛋白表达未发生显著变化（P＞0.05）,对T4刺激引起的G0/G1期阻滞没有影响,差异无统计学意义（P＞0.05）;CHIR99021使β-catenin及Cyclin D1蛋白表达水平明显增高（P?0.05）,GSK-3β蛋白表达水平明显减低（P?0.05）,KLF9蛋白表达水平未发生显著变化（P＞0.05）,部分逆转了T4刺激引起的G0/G1期阻滞,差异有统计学意义（P?0.01）。4、HT22细胞敲除KLF9后,与对照组相比,APC2、GSK-3β的蛋白表达水平显著降低（P?0.01）,β-catenin蛋白表达水平显著上调（P?0.01）。给予T4刺激后,KLF9敲除组与野生型HT22组相比,Cyclin D1蛋白表达水平增高（P?0.01）,细胞周期G0/G1期阻滞得到部分逆转（P?0.01）。5、采用双荧光酶报告基因分析方法进一步验证了KLF9可以结合在APC2的启动子区域。结论:1、母体甲状腺毒症损伤仔鼠成年时期空间学习记忆能力,但未明显影响焦虑情绪。2、母体甲状腺毒症后代成年后海马CA1区结构异常。3、过量T4诱导海马神经细胞的细胞周期从而抑制细胞增殖。4、母体甲状腺毒症抑制Wnt/β-catenin通路,从而引起细胞周期阻滞,进而抑制海马神经元细胞增殖,可能是导致后代成年后学习及记忆障碍的机制之一。5、高甲状腺素促进转录因子KLF9表达,KLF9促进APC2的表达,KLF9可能部分参与甲状腺毒症导致的海马细胞发育和功能异常。