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目的: 探讨预知子皂苷(AFS)通过诱导活化型大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖抑制及凋亡,影响大鼠实验性肝纤维化进程的作用及机制。 方法: 1.AFS的提取及含量测定:中药预知子醇提物采用高效液相色谱法(HPLC)对预知子中的主要活性成分α-常春藤皂苷的含量进行测定。 2.体外实验: (1)以浓度为50μg/mL的AFS干预HSC-T6 24 h后观察细胞形态的改变。 (2)用MTT法检测不同浓度的AFS及其溶剂DMSO作用HSC-T6和人正常肝细胞HL-7702 12 h、24 h、48 h后对细胞增殖的影响。 (3)以不同浓度AFS干预HSC-T6 24h后,用Hoechst33258荧光染色法检测细胞凋亡率。 (4)流式细胞术检测不同浓度AFS干预HSC-T6 24 h后细胞早期凋亡及周期的影响。 (5)Western Blot法检测AFS干预HSC-T6 24 h后凋亡相关蛋白的表达情况。 3.体内实验: (1)将30只SD雄性大鼠随机分为正常组、模型组、AFS高(200 mg/kg)、中(100 mg/kg)、低剂量组(50 mg/kg)及秋水仙碱对照组(0.1 mg/kg)每组5只。除正常组外其他各组均按1 mL/kg腹腔注射四氯化碳(CCL4)与橄榄油混合液(4:6),正常组腹腔注射等体积的生理盐水,每周三次,共六周。第七周起,秋水仙碱组及AFS组按1mL/kg体积给予相应的药物,模型组及正常组灌注等体积的生理盐水,1次/日,持续6周后处死全部大鼠。 (2)取肝组织,以HE染色和天狼猩红染色观察各组肝组织结构变化以及胶原纤维表达情况。 (3)免疫组织化学法检测各组大鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达情况。 (4)各组大鼠心脏取血检测血清中谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)及总胆红素(TBIL)水平的变化。 (5)用碱性水解法检测各组大鼠肝组织中羟脯氨酸(Hyp)的含量。 结果: 1.获得了预知子粗提取物110g,测得样品中α-常春藤皂苷含量为20.815 mg/g。 2. 体外实验: (1)HSC-T6经AFS干预后,药物处理组细胞收缩,变圆与周围细胞失去连接,并出现脱壁现象。 (2)AFS 药物组对HSC-T6有明显的增殖抑制作用并表现为浓度及时间依赖性,但对人肝细胞HL-7702无明显的毒性作用。 (3)AFS对HSC-T6有诱导凋亡的作用且表现为一定的量效关系,各AFS药物组与空白对照组比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01)。 (4)AFS可使HSC-T6的细胞周期阻滞在G2/M期并且诱导细胞出现早期凋亡,各AFS药物组与空白对照组比较,差异具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。 (5)各AFS药物组可上调HSC-T6内Bax、cleaved-caspase3的表达,而减少Bcl-2和pro-caspase3的表达,各AFS浓度组与空白组比较,差异具有统计学意义(P<0.01)。 3.体内实验: (1)各组大鼠肝脏HE染色可见,正常组肝组织结构完整,肝细胞索排列整齐无明显炎细胞浸润,而模型组肝细胞大量变性、坏死,小叶内大量炎细胞浸润,并可见假小叶形成,各药物组肝细胞变性、坏死程度较模型组减轻,其中AFS高剂量组肝脏结构与正常组更为接近。 (2)各组肝组织经天狼猩红染色可见,正常组仅有极少量染成红色的胶原纤维存在于汇管区周围,而模型组肝组织可见大量粗大的胶原纤维并向周围组织延伸,各药物组肝组织胶原纤维的表达较模型组减少(P<0.05),其中预知子中、高剂量组减少更为明显(P<0.01)。 (3)模型组肝组织可见大量α-SMA的表达,与正常组比较,差异具有显著的统计学意义(P<0.01);秋水仙碱组和各AFS组α-SMA的表达量较模型组显著下降(P<0.01),其中AFS中、高剂量组的表达量较秋水仙碱组减少更为明显(P<0.05)。 (4)各组大鼠肝功能检测结果显示:模型组血清中AST、ALT、TBIL水平较正常组明显升高(P<0.01),与模型组比较各药物组AST、ALT、TBIL血清水平降低(P<0.05或P<0.01),其中AFS中、高剂量组ALT水平以及高剂量组TBIL水平较秋水仙碱组降低更为显著(P<0.01)。 (5)与正常组比较,模型组肝组织中Hyp含量明显升高(P<0.01),各药物组Hyp含量均明显低于模型组(P<0.01),其中AFS高剂量组较秋水仙碱组降低更为显著(P<0.05)。 结论: 本实验所选用的中药预知子质量可靠,经提取后得到的AFS对体外培养的HSC-T6有增殖抑制作用,但对正常人肝细胞HL-7702无明显的毒性作用;AFS可诱导HSC-T6发生凋亡,其作用可能是通过依赖caspase凋亡途径而介导的;AFS可以减少由CCL4诱导的纤维化肝脏中胶原纤维的含量,改善肝功能,并减少活化型HSC的数量,这可能是AFS延缓肝纤维化进程的机制之一。