论文部分内容阅读
【目的】 证明去乙酰化酶ACY1（aminoacylase 1）与P62（sequestosome 1）蛋白相互作用，阐明ACY1与P62相互作用调控自噬的新机制。 【方法】 分别将状态良好的HeLa、HepG2、Hek293细胞铺到六孔板中，每种细胞铺两个孔分别作为实验组和对照组，待细胞密度达60%时，利用脂质体转染法过表达ACY1-GFP质粒，24h后实验组加入Bafilomycin A1作用4h，利用免疫荧光技术染GFP标签蛋白和P62蛋白，通过激光扫描共聚焦显微镜观察ACY1蛋白和P62蛋白共定位情况；然后将HeLa细胞铺三个大皿，实验组分别转染HA质粒和ACY1-HA质粒，24h后收集细胞用HA抗体通过免疫共沉淀实验验证ACY1与P62的相互作用；同样方法在纯内源条件下验证ACY1与P62的内源性相互作用。然后将P62质粒分成若干区段并过表达各段质粒，利用免疫共沉淀实验和免疫荧光实验验证ACY1和P62相互作用区段。然后梯度转染GFP-ACY1质粒，利用免疫印迹实验检测P62蛋白及自噬相关蛋白LC3的变化。进一步用自噬诱导条件饥饿处理不同时间梯度，通过免疫印迹实验检测ACY1调控自噬对饥饿条件的响应。 【结果】 1. 过表达ACY1条件下，免疫荧光显示ACY1和P62蛋白出现共定位现象；加入自噬溶酶体途径抑制剂后ACY1和P62蛋白降解减少，二者的共定位现象更明显。外源过表达ACY1或P62质粒的条件下，免疫共沉淀实验验证ACY1蛋白和P62蛋白有相互作用；同样在纯内源下，两者也存在着相互作用。P62蛋白初次分段和进一步分段免疫共沉淀实验研究显示，ACY1与P62的相互作用区段在P62蛋白的90-190氨基酸结构域；免疫荧光实验也验证了两者的相互作用区段。 2. 在HeLa和HepG2细胞中梯度过表达ACY1，免疫印迹实验发现随着ACY1浓度增高，P62蛋白表达水平逐渐降低，并且自噬相关蛋白LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ表达量同时减少，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ发生转化。 3. 在饥饿刺激条件下，免疫印迹实验表明随着饥饿时间的延长，ACY1蛋白表达逐渐降低，同时P62蛋白表达也逐渐降低、LC3-Ⅰ逐渐向LC3-Ⅱ发生转化。 【结论】 1. ACY1蛋白与P62蛋白相互作用。 2. ACY1与P62相互作用来调控自噬。 3. ACY1调控自噬的过程响应饥饿条件的诱导。