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目的:本实验通过复制大脑中动脉阻塞大鼠模型(Middle cerebral artery occlusion,MCAO),并从信号通路P-AKT/m TOR与星形胶质细胞(astrocytes,AS)的关系探究电针改善MCAO模型大鼠神经功能的机制。方法:SPF级健康雄性Wistar大鼠120只,重量(250±10)g,由北京维通利华实验动物技术有限公司提供,适应性饲养7d后,随机分为假手术组和造模组,假手术组20只,造模组100只。然后将造模组大鼠进行MCAO模型操作。将造模成功后符合标准的100只大鼠随机分为内关组、地机组、模型组、抑制剂组、假手术组。抑制剂组于造模成功24小时后侧脑室注射LY294002,然后进行内关穴针刺。内关组针刺内关穴、地机组针刺地机穴,连接电针仪,20min/次,每天1次,共7d。模型和假手术组仅用异氟烷麻醉20min,不予以针刺干预。运用神经功能评分、走横木实验(Beam walking test,BWT)、旷场实验及步态分析等方法评定大鼠神经功能损伤情况;运用激光散斑法检测各组大鼠软脑膜微循环情况;运用TTC检测各组大鼠脑梗死灶大小;HE染色检测大鼠脑神经细胞损伤情况;然后运用荧光定量PCR进行m RNA检测,免疫荧光及Western Blot检测胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein,GFAP)、磷酸化蛋白激酶B(Phosphorylated protein kinase B,P-AKT)、磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated mammalian target of rapamycin,P-m TOR)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspastic acid-specific protease 3,caspase-3)、半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteine aspastic acid-specific protease 9,caspase-9)、音猬因子(sonic hedgehog,Shh)蛋白表达,探讨电针通过P-AKT/m TOR通路调控星形胶质细胞增殖活化及凋亡水平减轻大鼠缺血性脑损伤的机制。结果:1.电针治疗能显著改善MCAO模型大鼠的神经功能和运动能力。神经功能评分结果显示,假手术组大鼠手术前后神经功能无明显变化。模型组大鼠神经功能评分明显高于假手术组(P<0.001),电针内关穴治疗7d后内关组与模型组比较,神经功能评分明显降低(P<0.01),但针刺内关穴的治疗作用被脑室内注射LY294002所抑制,地机组较模型组评分降低(P<0.05)。BWT显示,假手术组BWT评分明显高于模型组大鼠(P<0.0001),针刺内关穴大鼠的BWT表现优于模型组、地机组、抑制组(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。抑制剂组与地机组、模型组无显著性差异。旷场实验结果显示,假手术组的运动距离明显大于模型组,具有显著性差异,有统计学意义(P<0.001)。内关组大鼠运动距离高于模型组(P<0.05),抑制剂组与地机组、模型组相比无明显差异。步态分析结果显示,模型组大鼠持续运动时间高于假手术组,相比具有显著性差异(P<0.01),内关组大鼠的运动持续时间小于模型组、地机组(P<0.05,P<0.001),模型组、地机组、抑制组运动时间差别不大,没有统计学意义。抑制剂组大鼠爬行平均速度小于假手术组(P<0.05),内关组大鼠爬行平均速度高于抑制剂组,模型组、地机组。抑制剂组、模型组、地机组运动速度相近,三者无显著差异,没有统计学意义。2.电针能够明显促进MCAO模型大鼠患侧软脑膜代偿微循环建立,激光散斑结果显示地机组、内关组、抑制剂组患侧软脑膜血流量高于健侧,其中内关组改善最为明显。模型组软脑膜血流量r CBF变化率与假手术组有差异(P<0.05)。内关组大鼠软脑膜微循环血流量显著高于模型组、地机组及抑制剂组。抑制剂组软脑膜血流量与模型组、地机组无明显差异,无统计学意义。3.电针内关穴能够明显减少MCAO模型大鼠大脑梗死体积。假手术组大鼠大脑未见梗死灶,内关组、地机组、模型组、抑制剂组大鼠都有不同程度的脑组织梗死灶,其中内关组梗死体积较地机组、模型组、抑制剂组减小,模型组与假手术组比较有显著差异,有统计学意义(P<0.01)。4.HE结果显示,假手术组大脑皮质及海马神经细胞排列整齐、形态结构完整、细胞大小正常,核仁清晰,未见梗死区。模型组大鼠脑组织呈现不同程度的萎缩、液化及坏死,间隙疏松。海马CA1区锥体细胞损伤,严重者锥体细胞片状消失。而内关组细胞损伤较模型组有所减轻,细胞排列渐密集,胞核较清晰,炎性细胞浸润减少,空泡样坏死较少。地机组与抑制剂组均有损伤,两者相差不大。5.免疫荧光结果显示,在缺血半暗带脑组织中P-AKT、P-m TOR、caspase-3、caspase-9呈绿色荧光,GFAP呈红色荧光,P-AKT、P-m TOR、caspase-3、caspase-9与GFAP共表达部位呈黄色荧光。地机组、抑制组、内关组、模型组中P-AKT、P-MTOR与GFAP共表达高于假手组,其中内关组上升最为明显,与模型组相比具有显著性差异(P<0.05,P<0.01,P<0.001)。地机组、抑制组、内关组、模型组中caspase-3、caspase-9与GFAP共表达高于假手组,其中模型组上升最为明显,假手术组与之相比具有显著性差异(P<0.01,P<0.05)。缺血半暗带脑组织中Shh呈绿色荧光,神经元呈红色荧光,Shh与神经元共表达部位呈黄色荧光。内关组中Neu N与Shh共表达高于假手术组、地机组、抑制剂组、模型组,其中内关组与模型组、假手术组相比有统计学意义(P<0.05)。缺血半暗带脑组织中Shh呈绿色荧光,GFAP呈红色荧光,Shh与GFAP共表达部位呈黄色荧光。内关组中GFAP与Shh共表达高于假手术组、地机组、抑制剂组、模型组,其中内关组与假手组相比有显著差异,有统计学意义(P<0.05)。6.RT-PCR结果显示,在GFAP m RNA中,内关组表达明显高于假手组、地机组、模型组、抑制剂组。其中内关组与模型组比较有显著性差异,有统计学意义(P<0.0001),地机组、抑制剂组与内关组相比(P<0.0001,P<0.001)。在AKT m RNA中,内关组表达较其他四组明显升高,其中内关组与模型组相比(P<0.05),地机组、抑制剂组与内关组相比(P<0.05)。在m TOR m RNA中,内关组表达较其他四组明显升高,其中内关组与模型组相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.001),地机组、抑制剂组与内关组相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.0001)。在caspase-3 m R NA中,模型组表达较其他四组明显升高,模型组与假手术组相比有极显著性差异,有统计学意义(P<0.0001),内关组与模型组相比有显著性差异(P<0.001)。在caspa se-9 m RNA中,模型组表达较其他四组明显升高,其中模型组与假手术组相比有显著性差异,有统计学意义(P<0.05)。7.Western blot结果显示,内关组、模型组、地机组、抑制剂组GFAP表达较假手术组均升高,内关组上升最为明显(P<0.05)。p-AKT在假手术组、内关组、模型组、地机组、抑制剂组表达均增高,内关组升高最明显。模型组较内关组相比,增高明显(P<0.05),内关组较假手术组增高更明显(P<0.01)。p-m TOR结果表达趋势与GFAP、p-AKT一致,内关组较模型组、地机组、抑制组均升高,相比均具有显著性差异(P<0.01),抑制剂组、模型组、地机组差异不明显。针刺内关穴后梗死区域caspase-3、caspase-9与模型组、地机组、抑制组相比减少,抑制剂组与地机组差别不大,模型组与假手术组相比有显著性差异(P<0.05,P<0.01)。内关组、模型组、地机组、抑制剂组中音猬因子(sonic hedgehog,Shh)表达较假手术组均升高,内关组较假手术组上升较明显(P<0.01),地机组、模型组、抑制剂组差别不大,没有统计学意义。结论:电针内关穴可明显改善MCAO模型大鼠神经功能,提高其运动能力和运动积极性,促进模型大鼠患侧软脑膜微循环代偿,减小模型大鼠脑梗死体积,减少神经细胞凋亡。其机制可能与电针内关穴通过激活AS内P-AKT/m TOR信号通路,调控其增殖活化以及凋亡有关,并与促进神经细胞Shh分泌有关。