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朊蛋白疾病（Prion Disease）又称做传染性海绵状脑病（Transmissible Spongiform Encephalopathies,TSEs）,是一组能够感染人和动物的神经退行性传染病。牛海绵状脑病（Bovine Spongiform Encephalopathy,BSE）俗称疯牛病,是TSEs的一种,属于牛的慢性消耗性致死性传染病。朊蛋白疾病的致病机制不同于病毒和细菌,其致病因子是一种不含核酸具有传染性的蛋白质,它是细胞型朊蛋白（Cellular Prion Protein,PrPc）发生错误折叠后形成致病型朊蛋白(Scrapie Prion Protein,PrPsc)。目前,关于此病尚无有效的药物治疗。加强疯牛病的诊断是预防此病流入我国的主要方法。抗PrP的单克隆抗体（Monoclonal Antibody,mAbs）是最近研究的热点,它不仅用于疯牛病的诊断,对其治疗也有一定作用。目的:本研究采用重组牛朊蛋白（Recombinat Bovine Prion Protein,rmBovPrP）的纯化复性产物作为免疫原,免疫的动物选用6周龄雌性朊蛋白基因敲除鼠(prnp-/-)。应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗牛朊蛋白mAb,为疯牛病的免疫诊断研究奠定基础。方法:将已构建好的E.coli BL21-pPROEX-htb-BovPrP的重组菌液活化、测序,待测序结果与GeneBank上牛PrP氨基酸顺序一致后,进行蛋白的大量表达。将活化的菌液加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）诱导表达,SDS-PAGE法鉴定表达产物。采用镍柱亲和层析法纯化融合蛋白,超声波破碎法裂解包涵体蛋白,透析法复性纯化的重组表达产物,紫外分光光度计检测蛋白的浓度。以6D11进口的单抗为一抗,Western blot分析重组牛朊蛋白的免疫反应性。以rmBovPrP蛋白作为免疫原,菌液蛋白作为对照免疫原,与弗氏完全佐剂1:1混合乳化,腹腔注射6周龄雌性prnp基因敲除鼠(prnp-/-),每只30μg。在第三次免疫之后,建立了抗BovPrP的间接ELISA检测方法、Western blot的检测方法。用已建立的间接ELISA、Western blot方法检测免疫鼠的血清。采用常规方法进行了细胞的融合,细胞融合之前Western blot检测SP2/0细胞内PrPc的表达量。以牛的重组蛋白作为抗原,用建立的间接ELISA方法进行筛选,采用有限稀释法,经过三次亚克隆,最终获得一株杂交瘤细胞,命名为5C9D6。双抗夹心法检测其Ig类和亚类,Western blot分析5C9D6的特异性。结果:本实验获得了纯化良好的重组牛的朊蛋白,最终浓度稀释至1μg/ul。建立了间接ELISA检测方法,抗原的最佳包被浓度为0.02μg/ml,血清的最佳稀释度为1:800,最佳封闭液为1%脱脂乳,一抗、二抗的最佳作用时间均为60min。用间接ELISA方法检测小鼠体内的免疫血清效价在1:6400以上。SP2/0细胞内无PrPc的表达,可作为融合细胞。5C9D6抗体属于IgG2a。Westem blot表明5C9D6杂交瘤细胞株具有较强的特异性,与健康牛、鼠脑正常型PrPc有一定的反应性。