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红霉素(erythromycin，Er)是糖多孢红霉菌(Saccharopolyspora erythraea)的次生代谢产物,为一类广谱大环内酯类抗生素。近几年上市的第三代大环内酯类红霉素及其衍生物(又称为酮内酯类抗生素ketolide antibiotics),因具有较高的抗菌活性和显著的抑制呼吸道耐药菌株活性而具有广阔的开发前景。为探寻经基因工程途径直接改造糖多孢红霉菌的染色体结构而合成的新酮内酯类化合物DOEB产量大大下降的原因,本文以糖多孢红霉菌突变体M为研究对象,分别从基因的转录水平、翻译水平和内酯类化合物前体水平,系统研究了糖多孢红霉菌M合成DOEB的限速因子。研究结果如下: 在mRNA稳定性研究中,首先提取、纯化糖多孢红霉菌总RNA,进行mRNA反转录,以获得的cDNA为模板,采用ABI real-time quantitive7500仪器进行PCR扩增,实时监测扩增产物量的变化,计算mRNA的相对表达量(RQ=2-△△Ct),其中M菌株PKS-TE基因表达量是A226菌株PKS-TE基因表达量的0.65倍,平均下调了0.35倍;M菌株PKS-ACP基因表达量是A226菌株PKS-ACP基因表达量的0.69倍,平均下调了0.31倍。结果表明经基因工程改造的糖多红霉菌mRNA表达量稍显降低,其稳定性未受到明显影响。因为突变体DOEB产量下降千倍左右,所以mRNA转录水平并不是DOEB生物合成的限速因子。 在PKS蛋白稳定性研究中,以PKS复合体上的TE酶域为研究对象,采用生物信息学对TE蛋白氨基酸序列分析,化学合成抗原免疫家兔,分离抗血清，Elisa鉴定抗体效价。此后提取糖多孢红霉菌A226/M不同时期总蛋白,Bradford法测定其浓度,取等量的各时期菌蛋白与抗体进行ELISA检测,数据结果表明突变体M比工程菌A226蛋白表达量稍有降低,基因突变后PKS蛋白的稳定性亦未受到明显影响。同时取等量的各时期总蛋白进行考马斯亮蓝-银染复染法检测PKS蛋白复合体的表达情况,进一步证明突变体M和工程菌A226合成的PKS蛋白复合体表达量没有明显差异,排除了翻译水平的限速因子可能性。 在DOEB及其前体稳定性研究中,提取糖多孢红霉菌M和A226不同时期的发酵液,利用LC-MS技术检测DOEB及其前体表达水平。结果表明,造成M突变体DOEB产量下降的原因是由于在KR6突变菌株合成DOEB前体模块的过程中,相对于A226菌株而言,模块5产物的起始合成量降低,并且随着发酵时间的增加,模块5产物检测量增大,发生了累积;同时,合成的DODEB在向DOEB转化的过程中也受到EryF和底物亲和反应效率降低的影响,使得DODEB转化速率降低,不能完全转化,最终导致生物合成DOEB的能力大大降低,并且DOEB向红霉素A合成的路径被阻断。