背景支气管哮喘（哮喘）是一种常见的慢性气道炎症性疾病,以频繁反复发作性的气短、咳嗽、胸闷或气急等为主要症状,严重影响着各地区各年龄段患者的生存质量。目前,全球哮喘患者最少达2.4亿人,中国哮喘病人约3000万,且患病率仍逐年上升。尽管全球哮喘防治创议的推行使得大多数哮喘患者病情得到控制,但哮喘仍然不能根治。目前,哮喘以对症治疗为主,糖皮质激素是首要治疗药,但因其存在周期长,副作用多,且有近40%的患者对糖皮质激素治疗不敏感等问题,临床上亟待寻找一种更为安全有效的哮喘治疗或辅助治疗药物。雷公藤又名“断肠草”,是中医药宝库中著名的“以毒攻毒”的神秘药物,与砒霜齐名,其主要成分雷公藤红素及雷公藤甲素被《Cell》杂志列为最有可能也最值得开发为现代药物的天然化合物。雷公藤多苷是中国传统中医药,提取自雷公藤植物根,具有抗炎、抗肿瘤、免疫抑制等疗效,对类风湿性关节炎及哮喘等疾病有治疗作用。中药通过多成分-多靶标-多途径相互交联,协同发挥疾病的治疗作用,因此,系统而全面的阐明中药对疾病的治疗机制需借助一定的技术手段。网络药理学综合计算机技术及系统的生物学理论,可较为全面的分析中药治疗疾病的潜在作用机制。本研究拟综合网络药理学及蛋白质芯片来揭示雷公藤多苷及其组成成分对哮喘治疗的潜在机制。该研究主要分为两部分,第一部分基于网络药理学及初步的体外实验探讨雷公藤多苷治疗哮喘的主要成分及潜在机制;第二部分基于蛋白芯片技术,探讨雷公藤多苷的主要成分雷公藤甲素对哮喘气道重塑的影响。第一部分基于网络药理学探讨雷公藤多苷治疗哮喘的主要成分及潜在机制目的利用网络药理学探索雷公藤多苷治疗哮喘的主要成分及潜在机制。方法1.在中国知网及PubMed数据库中获取雷公藤多苷的组成成分,并通过筛选药物的吸收、分布、代谢和排泄等信息,收集雷公藤多苷的活性成分。2.通过中药系统药理学分析平台、中药高通量实验和参考数据库及PubChem获取各活性成分的靶标,通过Drugbank、DisGeNET和GeneCards获取哮喘的疾病基因,两者取交集获得雷公藤多苷治疗哮喘的潜在靶标。3.利用DAVID在线分析工具将雷公藤多苷抗哮喘潜在靶标进行GO及KEGG功能富集分析,并利用Cytoscape 3.6.0构建成分-靶标-通路网络。4.利用Autodock软件将雷公藤多苷抗哮喘的主要活性成分与潜在蛋白靶标进行分子对接,并进行可视化。5.用细胞划痕实验、Transwell迁移实验观察雷公藤多苷对支气管上皮细胞迁移能力的影响,用RT-PCR方法检测气道重塑相关分子CDH1及FN1的表达变化。结果1.通过检索数据库,共获取雷公藤多苷的组成成分36种,活性成分12种,活性成分靶标335个,并得到2672个哮喘相关基因。将药物活性成分靶标与哮喘基因取交集,获得204个雷公藤多苷治疗哮喘的潜在靶标。2.利用Cytoscape 3.6.0构建蛋白互作网络并分析其拓扑指数发现,RELA、TP53及AKT1是拓扑指数排名前三的靶标蛋白。3.雷公藤多苷治疗哮喘的主要活性成分为雷公藤甲素和雷公藤红素。雷公藤多苷可通过Toll样受体信号通路、TNF信号通路、NOD样信号通路、凋亡和HIF-1信号通路发挥抗哮喘的作用。4.雷公藤多苷可抑制支气管上皮细胞的迁移能力,显著改善经TGFβ1刺激的支气管上皮细胞中气道重塑相关分子CDH1及FN1的mRNA表达水平。第二部分基于蛋白芯片探讨雷公藤甲素对哮喘气道重塑的影响目的利用液相蛋白芯片及蛋白磷酸化芯片技术探讨雷公藤甲素对哮喘气道重塑的影响。方法1.利用CCK8实验找出药物最适浓度,利用细胞划痕实验、Transwell迁移实验及RT-PCR实验检测雷公藤甲素对TGFβ1刺激支气管上皮细胞迁移及气道重塑相关分子表达的影响。2.用单独或联合了雷公藤甲素的TGFβ1作用支气管肺上皮细胞16HBE,分别获取对照组、刺激组（TGFβ1刺激48h）和加药组（TGFβ1+雷公藤甲素刺激48h）的细胞培养上清和细胞,利用液相蛋白芯片获取各组差异表达的细胞因子,利用蛋白磷酸化芯片获取各组差异表达的蛋白质分子和蛋白磷酸化位点。3.将差异表达的蛋白进行GO及KEGG功能及通路富集分析,进一步揭示雷公藤甲素作用TGFβ1刺激支气管上皮细胞的相关信号分子。4.利用酶联免疫吸附实验及Western Blot对芯片结果进行验证。结果1.细胞划痕实验及Transwell迁移实验证实雷公藤甲素可抑制支气管上皮细胞的迁移。RT-PCR结果发现,雷公藤甲素可改善支气管上皮细胞中气道重塑相关分子的表达。2.液相蛋白芯片的结果显示,支气管上皮细胞受到TGFβ1刺激后,血管内皮生长因子（VEGF）的分泌明显增加,经雷公藤甲素作用后,其分泌明显下降;后续ELISA验证结果与芯片结果一致,即雷公藤甲素降低了支气管上皮细胞VEGF的分泌。3.蛋白磷酸化芯片显示,雷公藤甲素作用于经TGFβ1刺激的支气管上皮细胞后,共检测到82个差异表达的蛋白,其富集于刺激应答这一生物过程及MAPK和PI3K-AKT信号通路。对蛋白及蛋白磷酸化位点综合分析后发现,雷公藤甲素可逆转TGFβ1刺激支气管上皮细胞中ACC1、NFκB-p65（Phospho-Ser529）等13种蛋白的表达,这些蛋白主要富集于凋亡、MAPK信号等信号通路。Western blot验证结果显示,雷公藤甲素可影响MAPK及PI3K-AKT信号通路并靶向蛋白 NFκB-p65（Phospho-Ser529）。结论1.雷公藤多苷用于治疗哮喘的主要活性成分为雷公藤甲素和雷公藤红素。雷公藤多苷可能通过靶向基因RELA、TP53和AKT1及影响Toll样受体信号通路、TNF信号通路、NOD样信号通路、凋亡和HIF-1信号通路发挥抗哮喘作用。2.雷公藤甲素可抑制TGFβ1刺激支气管上皮细胞中VEGF的分泌,并通过调控MAPK、PI3K-AKT信号通路和靶向NFκB-p65（Phospho-Ser529）信号分子抑制哮喘气道重塑。