【摘 要】
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目的:葡萄胎（Hydatidiform mole,HM）是一种以胚胎发育停滞、绒毛水肿和滋养层细胞过度增生为特征的人类异常妊娠,其发生机制尚未完全明确。现有的研究表明复发性的葡萄胎与母源效应基因高度相关。PADI6作为母源效应基因成员之一,不仅在卵母细胞成熟和受精卵发育中起着重要作用,而且在细胞骨架重组、调控细胞器的定位和再分布中发挥着关键作用。然而,目前对PADI6和HM的研究大多集中在胚胎发育
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目的:葡萄胎（Hydatidiform mole,HM）是一种以胚胎发育停滞、绒毛水肿和滋养层细胞过度增生为特征的人类异常妊娠,其发生机制尚未完全明确。现有的研究表明复发性的葡萄胎与母源效应基因高度相关。PADI6作为母源效应基因成员之一,不仅在卵母细胞成熟和受精卵发育中起着重要作用,而且在细胞骨架重组、调控细胞器的定位和再分布中发挥着关键作用。然而,目前对PADI6和HM的研究大多集中在胚胎发育异常上,对其是否影响滋养细胞功能仍不清楚。YAP是Hippo信号通路的重要下游调节因子,具有控制细胞生长和侵袭作用。因此本研究通过调控PADI6在滋养细胞中表达变化,观察其对YAP的调控作用及其对滋养细胞功能的影响,并进一步挖掘PADI6与YAP的互作关系,从而探索PADI6调控滋养细胞功能的机制。方法:1.本研究收集30例完全性葡萄胎和部分性葡萄胎组织,以及正常早期妊娠人流标本10例作为对照,利用免疫组化检测P57、Ki-67、PADI6和YAP在葡萄胎组织和流产组织中的表达。同时收取了辅助生殖术后废弃的受精卵,利用免疫荧光检测PADI6和YAP的表达和定位。2.以人正常滋养细胞系HTR-8/Svne和人绒癌细胞系JAR为实验对象,通过si RNA和过表达慢病毒调控PADI6的表达变化。3.通过流式细胞术检测过表达和低表达PADI6的滋养细胞系的周期分布差异和细胞凋亡情况。通过transwell和细胞划痕实验探索PADI6在影响滋养细胞系细胞侵袭和迁移中的作用。应用Ed U检测PADI6的表达变化对滋养细胞系的增殖能力的影响。4.利用免疫荧光实验检测PADI6和YAP在人滋养细胞系的定位情况。利用免疫共沉淀研究PADI6和YAP的互作关系。结果:1.免疫组化结果表明PADI6和YAP定位于葡萄胎组织的细胞滋养层细胞的细胞核中,二者的表达具有一致性,即同时表达或同时不表达的模式;免疫荧光结果发现,PADI6和YAP在受精卵中都有表达,初期PADI6定位于皮质下区域,YAP呈弥散状分布于细胞核中,随着受精卵的分裂发育,二者的表达定位重叠。2.在滋养细胞系中,PADI6可调控YAP的表达,沉默PADI6导致YAP表达下调,过表达PADI6可导致YAP表达上调。3.PADI6过表达可导致滋养细胞的细胞骨架成分F-actin和β-tubulin表达升高。4.利用流式细胞术检测处于各个细胞周期的细胞数,发现与对照组相比,在G0/G1期时,PADI6沉默组细胞数显著升高（P＜0.05）,PADI6过表达组则显著降低（P＜0.05）;在S期时,PADI6沉默组显著降低（P＜0.05）,PADI6过表达组无显著差异;在G2M期时,PADI6沉默组显著降低（P＜0.05）,PADI6过表达组显著升高（P＜0.05）。5.利用流式检测细胞凋亡发现,与NC组相比PADI6沉默组的细胞凋亡显著降低（P＜0.05）,PADI6过表达组细胞凋亡则显著升高（P＜0.05）。EDU染色结果发现PADI6过表达组细胞增殖显著高于对照组（P＜0.05）。6.通过细胞划痕实验和transwell实验,发现沉默PADI6后,滋养细胞的迁移和侵袭能力减弱,过表达PADI6后滋养细胞的迁移和侵袭能力增强。7.免疫荧光实验表明,PADI6和YAP在滋养细胞系共定位于细胞核中,通过co-IP实验证实了二者在细胞核内相互结合,形成蛋白复合物。结论:PADI6通过调控YAP的表达促进滋养细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭能力。PADI6与YAP在滋养细胞中相互结合形成蛋白复合物,两者的互作关系可能在影响胚胎发育和调控滋养细胞功能方面起着不可忽视的作用。PADI6是参与构成皮质下母源复合物的母源效应基因之一,虽然PADI6靶向YAP的调控机制还有待进一步研究,但是二者的相互作用将母源效应基因、皮质下母源复合物与Hippo/YAP通路串联了起来,这为我们全面了解胚胎发育调控以及HM的发病机制提供新的思路。
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