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肉鸡猝死综合征（Sudden death syndrome of broliers,SDS）是一种与心脏功能异常相关的营养代谢性疾病,此病发病急、病程短,通常发生于3周龄左右的肉鸡中,以发育良好、长势较快的肉雏鸡发生突然性死亡为特征。雏鸡发病前没有任何特定的临床症状或异常行为,突然出去失去平衡、鸣叫、猛烈拍打翅膀、肌肉强烈收缩等癫狂行为。SDS发病与多种营养和环境因素的异常有关,但该病的确切病因和发病机制尚不完全清楚。目前,众多学者都认为SDS发病是由肉鸡心脏损伤引起的,与心血管系统衰竭有关。根据大量文献报道和课题组前期研究发现,死于SDS的肉鸡血液中乳酸水平显著高于正常鸡。此外,通过灌胃或静脉给予肉鸡乳酸,均可诱导与SDS相似的心律失常和猝死现象的发生。过量乳酸的产生与葡萄糖发生酵解有关,当机体出现缺血、缺氧等应激情况时,会导致乳酸堆积、代谢紊乱进而损伤心肌细胞,引发心律失常,从而最终导致SDS的发生。因此,我们建立了乳酸中毒模型模拟肉鸡猝死,在模型中探究猝死肉鸡心肌细胞损伤的机制。1.乳酸处理对HL-1细胞损伤的作用研究体外培养小鼠心肌细胞（HL-1）,选用传至第三代、生长状况良好的细胞进行试验。分别用10 m M和20 m M乳酸处理HL-1细胞24 h后,收集细胞样品,进行后续试验。（1）利用普通光学显微镜观察HL-1细胞的形态及数量;（2）CCK-8法检测乳酸处理对HL-1细胞存活率的影响;（3）利用鬼笔环肽染色法对各试验组细胞骨架肌动蛋白染色,激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架肌动蛋白的变化情况;（4）利用Western Blot检测小G蛋白RhoA（RhoA）、Rho相关蛋白激酶1（Rho-associated protein kinase 1,ROCK1）、cofilin、P-cofilin蛋白表达水平以及P-cofilin/cofilin比值的变化。结果发现:（1）乳酸处理组中HL-1细胞密度降低、体积缩小、细胞贴壁性变差、折光性减弱、细胞轮廓增强、间隙加大;（2）乳酸处理组细胞存活率显著降低;（3）F-actin染色结果显示,乳酸处理组细胞肌动蛋白绿色荧光强度显著降低、应力纤维减少、骨架排列紊乱松散,细胞面积显著减小;（4）乳酸处理组HL-1细胞RhoA、ROCK 1、P-cofilin蛋白表达水平显著升高,P-cofilin/cofilin比值显著升高。结论:建立了乳酸中毒模型,乳酸处理导致HL-1细胞损伤,RhoA/ROCK信号通路被激活。2.RhoA/ROCK通路调控乳酸致心肌细胞骨架损伤的分子机制研究为进一步研究猝死肉鸡心肌细胞损伤的分子机制,本研究利用ROCK激酶特异性抑制剂Y-27632,抑制RhoA/ROCK通路,研究RhoA/ROCK通路调控乳酸致心肌细胞骨架损伤的分子机制。体外培养小鼠心肌细胞（HL-1）,使用Y-27632（10μM）与10 m M和20 m M乳酸共同处理HL-1细胞24 h,进行后续试验。（1）利用CCK-8法检测细胞存活率;（2）利用Western Blot检测HL-1细胞RhoA、ROCK 1蛋白表达水平;（3）利用鬼笔环肽染色法对各试验组细胞骨架肌动蛋白进行染色,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架形态。结果发现:（1）与乳酸单独处理相比,Y-27632与乳酸共同孵育可提高HL-1细胞的存活率;（2）Y-27632可抑制乳酸引起的RhoA/ROCK信号通路激活,RhoA、ROCK 1蛋白表达水平均受到抑制;（3）添加Y-27632后,乳酸处理引起的HL-1细胞骨架损伤有所缓解。结论:乳酸通过激活RhoA/ROCK信号通路介导HL-1细胞骨架重构,进而引起骨架损伤。3.胞浆钙超载对乳酸致心肌细胞骨架损伤的作用机制研究为进一步探究乳酸激活RhoA/ROCK通路引起细胞骨架损伤与胞浆钙稳态的关系,在本研究中,（1）用胞浆钙离子特异性探针,通过HL-1细胞在含钙和无钙培养基中进行不同时间的乳酸处理,利用荧光酶标仪检测HL-1细胞胞浆钙离子浓度;（2）乳酸处理HL-1细胞24 h后,Western Blot检测HL-1细胞钙/钙调素依赖性蛋白激酶II（Calmodulin-dependent protein kinase,Ca MK II）、钙蛋白酶1（Calpain 1）蛋白表达水平的变化;（3）选用10μM 2-APB（2-Aminoethoxydiphenyl Borate,内质网上钙离子通道受体IP3R抑制剂）与乳酸共同处理HL-1细胞,CCK-8检测细胞的存活率;（4）2-APB与乳酸共同处理HL-1细胞24 h后,WB检测HL-1细胞RhoA、ROCK 1蛋白表达水平的变化;（5）2-APB与与乳酸共同处理HL-1细胞24 h后,WB检测HL-1细胞Ca MK II、Calpain 1蛋白表达水平的变化;（6）2-APB与乳酸共同处理HL-1细胞作用不同的时间后,用荧光酶标仪对胞浆钙离子浓度进行检测;（7）2-APB与乳酸共同处理HL-1细胞24 h后,利用鬼笔环肽对细胞骨架肌动蛋白染色,激光共聚焦显微镜观察细胞骨架肌动蛋白的变化情况。结果发现:（1）与对照组相比,在含钙培养条件下,乳酸处理组HL-1细胞胞浆中钙离子浓度显著升高;同样在无钙培养条件下,乳酸处理组HL-1细胞,胞浆中钙离子浓度仍然显著升高;（2）与对照组相比,乳酸处理HL-1细胞后Ca MK II、Calpain 1蛋白表达水平显著升高;（3）与乳酸单独处理相比,2-APB与乳酸共同孵育可提高HL-1细胞的存活率;（4）与乳酸单独处理组相比,2-APB与乳酸共处理组HL-1细胞RhoA、ROCK 1蛋白表达水平显著降低;（5）与乳酸单独处理组相比,2-APB与乳酸共处理组HL-1细胞Ca MK II、Calpain 1蛋白表达水平显著降低;（6）与乳酸单独处理组相比,2-APB与乳酸共处理组中胞浆钙离子浓度显著降低;（7）与乳酸单独处理组相比,2-APB与乳酸共处理组F-actin染色结果显示,骨架损伤程度有一定缓解。结论:乳酸处理HL-1细胞可破坏细胞钙稳态,引起胞浆钙超载,激活RhoA/ROCK信号通路引起细胞骨架损伤。综上所述,乳酸酸中毒可使HL-1细胞形态改变、存活率降低、细胞骨架受损,表明乳酸酸中毒模型可作为肉鸡猝死的体外细胞模型;乳酸可激活HL-1细胞RhoA/ROCK信号通路及下游信号分子,进而引起细胞骨架损伤;进一步研究发现胞浆钙超载是激活RhoA/ROCK信号通路的关键因素,且超载的钙离子主要来源于内质网。本研究建立体外细胞模型,从钙稳态与细胞骨架相关性的角度,探究肉鸡猝死心肌细胞损伤的分子机制,为SDS的发病机制及防控靶点研究奠定理论基础。