喜树碱（Camptothecin, CPT）由于高效、广谱的抗肿瘤活性而位居癌症治疗前列，但明显的毒副作用限制了它在临床上的使用，因而开发抗肿瘤活性强、毒副作用小的衍生物成为了国内外研究热点。9-甲氧基喜树碱（9-Methoxycamptothecin, MCPT），一种喜树碱衍生物，体内外试验均证实有明显的抗多种肿瘤活性，但对其有关细胞和分子方面的机制研究极少。本课题首先体外评价了9-甲氧基喜树碱的抗肿瘤细胞活性，并从9-甲氧基喜树碱诱导肿瘤细胞凋亡、影响DNA拓扑异构酶活性及其与DNA分子相互作用等三个方面进行了作用机制的研究。1.评价9-甲氧基喜树碱体外抗肿瘤活性。结果表明，9-甲氧基喜树碱抑制7种肿瘤细胞系，呈剂量依赖性。其中，人卵巢癌细胞A2780和人宫颈癌细胞Hela对9-甲氧基喜树碱最为敏感，其IC50值分别为79±21nM和151±61nM，明显低于阳性对照药物10-羟基喜树碱（Hydroxycamptothecin，HCPT）。选取这两种细胞系开展后续作用机制研究。2.研究了9-甲氧基喜树碱诱导细胞凋亡作用及其机制。结果表明：（1）9-甲氧基喜树碱处理A2780和Hela细胞后，荧光显微镜下观察到诱导的凋亡细胞，流式细胞仪检测到明显的早期和晚期凋亡细胞。9-甲氧基喜树碱诱导A2780细胞的早期凋亡和总凋亡率增加具有时间-剂量依赖性；（2）9-甲氧基喜树碱处理A2780和Hela细胞24h后即表现出强的G2/M期阻滞。1×IC50浓度的9-甲氧基喜树碱处理A2780细胞24h后对G2/M期阻滞最明显，达到81.93%；（3）9-甲氧基喜树碱能使A2780和Hela细胞中产生活性氧（ROS）明显增多。A2780细胞中ROS产生量最高达到对照组的5.22倍，Hela细胞中最高为2.65倍；（4）9-甲氧基喜树碱能不同程度激活caspase-3，-8和-9。在A2780细胞中对caspase-9酶激活程度最强，是对照组细胞的15倍。Hela细胞中caspase-3的酶活性被显著提高，约为对照组细胞的8倍；（5）实时定量PCR检测到9-甲氧基喜树碱调节了17个内、外源性细胞凋亡通路及细胞周期相关基因。其中对细胞周期调控基因p21，p27和cyclinE上调较显著；且明显上调参与外源性细胞凋亡通路的TNFα、Fas和FasL；同时还调节了主要参与内源性细胞凋亡通路的bcl-2家族有关基因表达水平；（6）Westernblot检测到TNFα, Fas, P53和P27的蛋白表达水平上调，与其基因水平调节一致。综上所述，9-甲氧基喜树碱可通过调节细胞周期调控蛋白使细胞周期阻滞于G2/M期，并增加ROS的产生、调节bcl-2家族相关基因激活caspase-9，从而启动内源性细胞凋亡通路；同时激活了caspase-8启动以TNFα和Fas/FasL为主的外源性细胞凋亡通路。以上两条通路共同激活caspase-3，最终导致A2780和Hela细胞凋亡。3.研究了9-甲氧基喜树碱对DNA拓扑异构酶Ⅰ和Ⅱ活性的影响。结果显示，100μM的9-甲氧基喜树碱表现出对拓扑异构酶Ⅰ明显的抑制作用，与阳性对照药物喜树碱一样，可使超螺旋DNA产生明显的缺刻型DNA条带。不同浓度的9-甲氧基喜树碱均未表现出对拓扑异构酶Ⅱ的抑制作用（与阳性对照药物依托泊苷相比）。值得注意的是，100μM的9-甲氧基喜树碱能单独作用于超螺旋DNA并产生明显的缺刻型DNA产物，表明9-甲氧基喜树碱在没有拓扑异构酶Ⅰ存在的情况下也能作用于DNA。提示，9-甲氧基喜树碱的这种直接结合DNA的能力很有可能是其抗肿瘤活性强的一种重要机制。4.采用光谱法研究了9-甲氧基喜树碱与DNA分子相互作用。结果表明，（1）紫外-可见吸收光谱显示，随着不断滴加CT-DNA，9-甲氧基喜树碱最大吸收峰出现了增色效应，谱带未发生偏移，表明其与DNA的作用属于外部键合模式（沟槽作用和/或静电作用）。9-甲氧基喜树碱处理CT-DNA前后体系的解链温度（melting temperature,Tm）值升高不明显，也支持外部键合模式；（2）荧光光谱显示，随着CT-DNA浓度不断增加，9-甲氧基喜树碱荧光强度不断增强，没有发生明显光谱偏移现象，支持外部键合模式；（3）9-甲氧基喜树碱与CT-DNA相互作用的圆二色谱显示，9-甲氧基喜树碱加入后，体系的正峰有小的提升，而其负峰有较明显的回落并伴有轻微的吸收峰红移现象。由于负峰变化程度大于正峰，表明两者结合以沟槽模式为主。综上可知，9-甲氧基喜树碱与CT-DNA的结合方式以沟槽模式为主。综合以上研究结果表明，9-甲氧基喜树碱具有明显的抗多种肿瘤细胞活性，其作用机制主要是通过与拓扑异构酶Ⅰ-DNA形成三元复合物“路障”阻止DNA复制、以沟槽方式结合DNA并对其进行剪切、诱导肿瘤细胞凋亡而起到抗肿瘤作用。