论文部分内容阅读
目的：通过在体实验，观察仙鹤草水提取物对脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分、病理变化、氧化因子及抗氧化因子、神经递质和PI3K/Akt信号通路的影响；通过离体实验，观察仙鹤草水提取物对糖氧缺乏大鼠海马神经元细胞中神经递质的影响，探讨仙鹤草水提取物对脑缺血再灌注损伤的作用及其相关机制。
方法：(一)在体实验：采用大鼠大脑中动脉阻塞模型，SPF级SD大鼠随机分为5组假手术组、模型组、仙鹤草组、仙鹤草水提取物组、尼莫地平组，每组10只。采用Zealong五分级评法进行大鼠神经功能学评分；HE染色观察脑组织病理学改变；TTC染色观察并计算脑梗死面积及体积；采用Elisa试剂盒检测大鼠血清中SOD、NO的含量；用免疫荧光法检测P-Akt和NGF的表达量。
(二)离体实验：使用原代培养的海马神经元细胞，在CO2环境下建造糖氧缺乏的OGD模型。根据药物干预的不同分为正常组，OGD组，仙鹤草组、仙鹤草水提取物组、尼莫地平组5组。倒置显微镜下观察海马神经元的生长情况并用DAPI法鉴定，用比色法检测LDH外漏量，免疫荧光法检测P-Akt和NGF的表达水平。
结果：(一)在体实验
模型组与假手术组相比，神经功能评分显著上升(P<0.01)，治疗组和模型组相比，神经功能评分均有所下降(P<0.01，P<0.05)，其中仙鹤草水提取物组效果较为明显(P<0.01，P<0.05)。TTC染色结果显示，模型组与假手术组相比，脑梗死体积增高(P<0.01)，治疗组的脑梗死体积均有不同程度降低(P<0.01)，其中仙鹤草水提取物组作用效果较为显著(P<0.05，P<0.01)。
HE结果：假手术组大鼠脑组织中，神经细胞形态正常，仅偶见胞浆轻微肿胀现象。模型组中各细胞的间隙明显增大，有大部分细胞胞核碎裂，剩余部分的细胞胞核也有明显缩小，胞浆着色不均匀，神经纤维排列紊乱，有较多的中性粒细胞浸润。治疗组中，细胞损伤程度均有所改善，其中仙鹤草水提取物组只表现出轻微中性粒细胞浸润。
Elisa试剂盒检测结果：模型组的SOD活性低于假手术组(P<0.01)，各治疗组给药后，SOD均有升高，其中仙鹤草组作用较为明显(P<0.01)，仙鹤草水提取物组虽稍低于仙鹤草组(P<0.05)，优于尼莫地平组(P<0.01)。NO的表达，模型组高于假手术组(P<0.01)，治疗组中，仙鹤草水提取物组的作用最佳，NO的表达水平低于另外两组(P<0.01)。
免疫荧光法检测结果：模型组与假手术组相比，P-Akt、NGF表达量均有降低(P<0.01)，治疗组的P-Akt、NGF表达水平提高，其中仙鹤草水提取物组升高显著(P<0.01)，治疗效果较好，仙鹤草组效果次之，与仙鹤草水提取物组相比结果具有统计学意义(P<0.01)。尼莫地平组与模型相比P-Akt、NGF的表达量也有显著变化，差异具有极显著性(P<0.01)。
(二)离体实验
倒置显微镜下观察原代培养的海马神经元，发现接种2h后，电镜下即可观察到海马神经元，其体积为小圆形，至第6天后，神经元细胞的体积基本成熟，细胞的胞体折光度良好，突起分支增粗，网状结构致密，可以用于下一步实验。
DAPI法检测细胞核，发现细胞核呈蓝色，簇状或散在分布；MAP-2法检测神经元形态，可见神经元呈圆形，树突交织呈网状分布，细胞核不染色；Merge处理后，可见细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，确定海马神经元性质。
比色法检测LDH外漏量情况：不同的处理对OGD细胞LDH漏出量的影响差异较为显著，其中OGD组的漏出量较多，高于正常组及其他各组(P<0.01)；而各治疗组的漏出量均有不同程度的恢复，以仙鹤草水提取物组的恢复效果较为明显(P<0.01)，尼莫地平组效果优于仙鹤草组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
免疫荧光法检测结果：不同药物处理组神经元细胞中P-Akt、NGF含量的表达差异较为明显，其中OGD组明显低于正常组与各治疗组(P<0.01，P<0.05)，各治疗组中，仙鹤草水提取物组效果较为明显，优于另外两组(P<0.05)。与在体实验结果相一致。
结论：1.采用MCAO法和OGD法成功造模，为后期的研究奠定了模型基础。通过治疗，说明仙鹤及其水提取物在CIRI中具有相当的神经保护作用，其中，仙鹤草水提取物的效果较优。2.仙鹤草及其水提取物能够显著降低CIRI大鼠的神经功能评分及脑梗死体积，能够明显改善CIRI大鼠的病理学损伤，从而发挥较好的神经保护作用，其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草。3仙鹤草及其水提取物作用于CIRI大鼠，能够显著的提高SOD、P-Akt、NGF表达水平，抑制NO水平，具有很好的抑制细胞凋亡和抗氧化功能，其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草。4.离体实验表明，仙鹤草及其水提取物能够明显的减少细胞上清液中LDH的漏出量，增加P-Akt、NGF含量的表达，抑制神经细胞凋亡，保护OGD诱导的神经元损伤。其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草，与在体实验结果相一致。5.仙鹤草及其水提取物神经保护作用的作用机制可能为通过PI3K/Akt信号通路，发挥抑制细胞凋亡、抗氧化功能。
方法：(一)在体实验：采用大鼠大脑中动脉阻塞模型，SPF级SD大鼠随机分为5组假手术组、模型组、仙鹤草组、仙鹤草水提取物组、尼莫地平组，每组10只。采用Zealong五分级评法进行大鼠神经功能学评分；HE染色观察脑组织病理学改变；TTC染色观察并计算脑梗死面积及体积；采用Elisa试剂盒检测大鼠血清中SOD、NO的含量；用免疫荧光法检测P-Akt和NGF的表达量。
(二)离体实验：使用原代培养的海马神经元细胞，在CO2环境下建造糖氧缺乏的OGD模型。根据药物干预的不同分为正常组，OGD组，仙鹤草组、仙鹤草水提取物组、尼莫地平组5组。倒置显微镜下观察海马神经元的生长情况并用DAPI法鉴定，用比色法检测LDH外漏量，免疫荧光法检测P-Akt和NGF的表达水平。
结果：(一)在体实验
模型组与假手术组相比，神经功能评分显著上升(P<0.01)，治疗组和模型组相比，神经功能评分均有所下降(P<0.01，P<0.05)，其中仙鹤草水提取物组效果较为明显(P<0.01，P<0.05)。TTC染色结果显示，模型组与假手术组相比，脑梗死体积增高(P<0.01)，治疗组的脑梗死体积均有不同程度降低(P<0.01)，其中仙鹤草水提取物组作用效果较为显著(P<0.05，P<0.01)。
HE结果：假手术组大鼠脑组织中，神经细胞形态正常，仅偶见胞浆轻微肿胀现象。模型组中各细胞的间隙明显增大，有大部分细胞胞核碎裂，剩余部分的细胞胞核也有明显缩小，胞浆着色不均匀，神经纤维排列紊乱，有较多的中性粒细胞浸润。治疗组中，细胞损伤程度均有所改善，其中仙鹤草水提取物组只表现出轻微中性粒细胞浸润。
Elisa试剂盒检测结果：模型组的SOD活性低于假手术组(P<0.01)，各治疗组给药后，SOD均有升高，其中仙鹤草组作用较为明显(P<0.01)，仙鹤草水提取物组虽稍低于仙鹤草组(P<0.05)，优于尼莫地平组(P<0.01)。NO的表达，模型组高于假手术组(P<0.01)，治疗组中，仙鹤草水提取物组的作用最佳，NO的表达水平低于另外两组(P<0.01)。
免疫荧光法检测结果：模型组与假手术组相比，P-Akt、NGF表达量均有降低(P<0.01)，治疗组的P-Akt、NGF表达水平提高，其中仙鹤草水提取物组升高显著(P<0.01)，治疗效果较好，仙鹤草组效果次之，与仙鹤草水提取物组相比结果具有统计学意义(P<0.01)。尼莫地平组与模型相比P-Akt、NGF的表达量也有显著变化，差异具有极显著性(P<0.01)。
(二)离体实验
倒置显微镜下观察原代培养的海马神经元，发现接种2h后，电镜下即可观察到海马神经元，其体积为小圆形，至第6天后，神经元细胞的体积基本成熟，细胞的胞体折光度良好，突起分支增粗，网状结构致密，可以用于下一步实验。
DAPI法检测细胞核，发现细胞核呈蓝色，簇状或散在分布；MAP-2法检测神经元形态，可见神经元呈圆形，树突交织呈网状分布，细胞核不染色；Merge处理后，可见细胞核的染色质高度凝聚、边缘化，确定海马神经元性质。
比色法检测LDH外漏量情况：不同的处理对OGD细胞LDH漏出量的影响差异较为显著，其中OGD组的漏出量较多，高于正常组及其他各组(P<0.01)；而各治疗组的漏出量均有不同程度的恢复，以仙鹤草水提取物组的恢复效果较为明显(P<0.01)，尼莫地平组效果优于仙鹤草组，差异具有统计学意义(P<0.05)。
免疫荧光法检测结果：不同药物处理组神经元细胞中P-Akt、NGF含量的表达差异较为明显，其中OGD组明显低于正常组与各治疗组(P<0.01，P<0.05)，各治疗组中，仙鹤草水提取物组效果较为明显，优于另外两组(P<0.05)。与在体实验结果相一致。
结论：1.采用MCAO法和OGD法成功造模，为后期的研究奠定了模型基础。通过治疗，说明仙鹤及其水提取物在CIRI中具有相当的神经保护作用，其中，仙鹤草水提取物的效果较优。2.仙鹤草及其水提取物能够显著降低CIRI大鼠的神经功能评分及脑梗死体积，能够明显改善CIRI大鼠的病理学损伤，从而发挥较好的神经保护作用，其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草。3仙鹤草及其水提取物作用于CIRI大鼠，能够显著的提高SOD、P-Akt、NGF表达水平，抑制NO水平，具有很好的抑制细胞凋亡和抗氧化功能，其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草。4.离体实验表明，仙鹤草及其水提取物能够明显的减少细胞上清液中LDH的漏出量，增加P-Akt、NGF含量的表达，抑制神经细胞凋亡，保护OGD诱导的神经元损伤。其中仙鹤草水提取物的作用优于仙鹤草，与在体实验结果相一致。5.仙鹤草及其水提取物神经保护作用的作用机制可能为通过PI3K/Akt信号通路，发挥抑制细胞凋亡、抗氧化功能。