研究背景胆管癌起源于肝内胆管、肝门部和远端胆管树上皮细胞。尽管手术结合使用吉西他滨联合顺铂化疗有了重大改进,胆管癌患者的预后仍然较差,中位生存期少于一年。近十年来的研究表明,多种癌基因或抑癌基因的失调控与包括胆管癌的人类癌症的恶性进展有关。因此,揭示胆管癌发生和发展的潜在机制可能有助于建立有效的治疗策略。各种类型细胞分泌的趋化因子在趋化性中发挥核心作用。按照保守半胱氨酸残基的顺序,趋化因子被分为C、CC、CXC和C（X）3C四类,而CXC趋化因子又根据氨基末端ELR模序的存在与否进一步被分为ELR+CXC和ELR-CXC。许多研究表明,趋化因子参与肿瘤的发生和人类癌症的恶性进展相关,因此它们可能成为癌症治疗的潜在靶点。例如,研究发现肺癌细胞能利用CXCL12/CXCR4信号促进生长和远端扩散。CXCL5/CXCR2生物轴可以通过激活PI3K/AKT诱导的MMP2/MMP9上调来促进膀胱癌细胞的迁移和侵润。CXCL7是一种属于CXC趋化因子家族的血小板衍生生长因子,通过结合其受体CXCR2发挥强有力的中性粒细胞趋化和激活作用。已有研究表明,CXCL7参与到各种细胞进程,例如DNA合成、糖酵解、有丝分裂,细胞内cAMP累积、前列腺素E2分泌,以及透明质酸及纤溶酶原激活物的合成。此外,它也是一种具有杀菌和抗真菌活性的抗菌蛋白。最近,有研究发现人类癌症中CXCL7失调控,而且CXCL7在肿瘤生长中发挥作用。例如,有人发现CXCL7能促进透明细胞肾细胞癌的增长。据Desurmont等人报道,结肠癌肝转移病灶中CXCL7和CXCR2的过表达与无病生存期和总体生存期较短相关。然而,CXCL7在胆管癌中的调控作用从未被研究过。本研究旨在探讨胆管癌组织中CXCL7的表达,以及CXCL7对胆管癌细胞恶性表型的调控作用。研究方法第一部分:CXCL7表达与胆管癌疾病进展、预后不良有关1.组织样品收集这项研究获得我院医学伦理委员会批准。从我院共收集到156例胆管癌组织样本和35例邻近非肿瘤组织样本。所有样本均获得书面的知情同意书。参与这项研究的患者未曾接受术前化疗或放疗。所有的组织用福尔马林固定、石蜡包埋。2.免疫组化染色检测4μn厚组织切片经脱蜡后使用柠檬酸缓冲液在微波炉中进行热诱导的抗原修复22分钟,将切片同第一抗体室温孵育1小时,然后再与第二抗体室温孵育1小时。反应物用二氨基联苯胺底物显影并用苏木素复染。蛋白表达水平由三名病理学家独立评分。染色阳性细胞百分比分级为0级（没有染色）,阴性（-）;0<细胞阳性率≤25%,弱表达（+）;25%<细胞阳性率≤75%,中度表达（++）;细胞阳性率>75%,强表达（+++）。3.统计学方法计数资料数据以率和百分比表示。使用SPSS 17.0（SPSS公司,美国纽约州阿蒙克市）进行统计分析。计数资料两组之间的比较利用χ2检验。P<0.05为有统计学意义。第二部分:减少CXCL7表达抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭性1.细胞培养人胆管癌细胞系（HuCCT1、HuH28、QBC939、EGI-1、OZ 和 WITT）和人肝星状细胞系LX-1从中国科学院上海细胞库购买。所有细胞都在添加了10%胎牛血清（美国Gibco）的DMEM培养基（美国Gibco）中,在5%C02、37℃培养箱中培养。2.细胞转染根据生产商指示,使用脂质体2000进行细胞转染。简单地说,细胞培养生长至70%融合时在无血清的DMEM培养液中重悬。用无血清培养基分别稀释空白 pcDNA3,1 载体、pcDNA3.1-CXCL7 质粒、非特异性 siRNA、CXCL7 siRNA和脂质体2000。然后将稀释的脂质体2000加入稀释质粒或siRNA中,在室温孵育20分钟,然后加入细胞悬液。在37℃孵育6小时后,将培养基替换为正常含血清培养基。然后,在进行以下检测前培养细胞48小时。3.RT-PCR 分析使用Trizol试剂（美国Life Technologies公司）按照制造商的说明提取总RNA。使用反向转录试剂盒（美国Life Technologies公司）根据制造商的说明将800ng RNA转换成cDNA。然后使用荧光定量PCR检测试剂盒在ABI7500热循环仪上进行实时荧光定量PCR（美国Life Technologies公司）。PCR步骤:95℃10分钟,95℃变性15秒,60℃退火/延伸60秒,反应40个循环,GAPDH作为内参。用2-△△Ct法分析相对表达量。4.免疫印迹试验用冰冷的裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl,pH=6.8,100mM 2-ME,2%w/v SDS,10%的甘油）裂解细胞。蛋白质用10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离,然后转移到聚偏二氟乙烯膜（PVDF,美国Life Technologies公司）上。将PVDF膜与含有5%牛奶的PBS在4℃下过夜孵育。将膜用PBS清洗3次后,在室温下与第一抗原（Abcam公司、美国马萨诸塞州剑桥市）室温孵育3h。然后,将PVDF膜用PBS再清洗3次,并与第二抗体（Abcam公司）在室温下孵育1h。然后用Super Signal West Pico化学发光底物试剂盒（Pierce公司,美国伊利诺伊州罗克福德市）根据制造商的说明检测信号。用Image-Pro plus 6.0版软件进行蛋白相对表达量分析,检测值以与GAPDH的密度比表示。5.酶联免疫吸附试验（ELISA）将含10%胎牛血清的DMEM培养基中的细胞接种至6孔板（接种密度1.5×105细胞/孔）并培养48小时。然后,收集上清液在12000xg离心10分钟。使用人CXCL7 ELISA试剂盒按照制造商的说明检测CXCL7的分泌水平（Thermo Fisher 公司,美国）。6.MTT试验MTT试验用于检测细胞增殖。简单地说,将细胞按每孔10000个细胞的密度接种于96孔板。经过0、24、48和72小时培养后,将细胞同终浓度为0.5mg/ml的MTT在37℃孵育4小时。去除培养基,增入150mM的二甲基亚砜（DMSO）溶液。使用生物TekTM ELX 800TM吸光度酶标仪在570nm波长处读取吸光度。7.Transwell 试验用Transwell小室（美国BD公司）进行Transwell试验,检测细胞侵袭性。在无血清培养基中制备密度为5×105细胞/ml的细胞悬液,取300μl细胞悬液加到上室。然后,将500μl含10%胎牛血清的DMEM加入下室。将细胞孵育24h。然后,我们用棉签仔细擦出未迁移出孔的细胞。将过滤板在90%的酒精中固定并用苏木素染色,在倒置显微镜（奥林巴斯公司,日本东京）下观察。8.统计学方法所有数据均代表3次以上重复实验的结果。数据以平均值土标准差表示。使用SPSS 17.0（SPSS公司,美国纽约州阿蒙克市）进行统计分析。采用t检验分析了两组之间的差异。多样本均数的比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）,并检验方差齐性,方差相齐,两两比较采用LSD法;方差不齐,两两比较采用Dunnett’s T3法。P<0.05为有统计学意义。结果第一部分:CXCL7表达与胆管癌疾病进展、预后不良有关1.CXCL7上调与胆管癌进展有关联在本研究中,我们的数据表明CXCL7蛋白主要分布在细胞质。在66%（103/156）胆管癌病例中发现CXCL7阳性表达,而在邻近非肿瘤组织中只检测到23%（8/35）（P<0.05）。我们将胆管癌患者分为两组,CXCL7低表达组（表达阴性和弱表达）和CXCL7高表达组（中等和较强表达）。CXCL7高表达与低分化、淋巴结转移、血管浸润和胆管癌的临床晚期显著相关（P<0.05）。然而,CXCL7的表达与年龄、性别和肿瘤大小无关联（P>0.05）。随后,我们进一步研究了胆管癌中CXCL7蛋白表达与Ki67、CA199、AFP和p53蛋白表达的关系。CXCL7表达与Ki67表达有显著关联（P<0.05）。然而,胆管癌中CXCL7表达与CA199、AFP和p53蛋白表达无关联（P>0.05）。2.CXCL7表达增加与胆管癌患者预后差相关与CXCL7低表达的胆管癌患者相比,CXCL7高表达患者的总体生存期较短（P<0.05）。因此,CXCL7表达增加与胆管癌患者晚期进展和预后差相关联。第二部分:减少CXCL7表达抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭性1.CXCL7沉默抑制胆管癌细胞的增殖和侵袭性我们研究了包括 HuCCTI、HuH28、QBC939、EGI-1、OZ 和 WITT 的几种常见胆管细胞系中CXCL7和CXCR2的表达水平。由于QBC939细胞CXCL7和CXCR2表达水平最高,我们在接下来的试验中使用这种细胞系。为了沉默CXCL7表达,将CXCL7特异性siRNA或非特异性siRNA分别转染（阴性对照siRNA）至QBC939细胞。与对照组相比,CXCL7特异性siRNA转染显著降低CXCL7 mRNA和蛋白表达水平（P<0.05）。MTT试验和Transwell侵袭试验进一步表明,沉默CXCL7显著抑制QBC939细胞的增殖和侵袭（P<0.05）。这些数据表明,CXCL7在QBC939细胞恶性表型的调控中起着促进作用。将pcDNA3.1-CXCL7 ORF质粒或作为阴性对照组的空白载体分别转染至QBC939细胞。另外,在转染pcDNA3.1-CXCL7 ORF质粒后,CXCL7的mRNA和蛋白水平与对照组相比都明显增加（P<0.05）,而且CXCL7过表达显著促进QBC939细胞的增殖和侵袭（P<0.05）。综合考虑,我们证明CXCL7可以促进胆管癌细胞的增殖和侵袭。2.CXCL7以旁分泌依赖方式增强胆管癌细胞恶性表型由于非肿瘤细胞在肿瘤微环境中的也可以分泌CXCL7,我们用50ng/ml的重组人CXCL7处理QBC939细胞24小时。处理后,检测QBC939细胞的细胞增殖和侵袭性。与对照组相比,CXCL7处理显著增加QBC939细胞的增殖和侵袭性（P<0.05）。我们进一步研究了源于正常细胞的CXCL7对胆管癌细胞恶性表型的影响。人肝星状细胞系LX-1分别用CXCL7 ORF质粒或空白载体转染。在转染CXCL7 ORF质粒后,LX-1细胞中CXCL7的mRNA和蛋白水平与对照组相比都明显增加（P<0.05）。ELISA试验数据进一步表明,CXCL7过表达LX-1细胞的条件培养基中的CXCL7水平均高于对照组（P<0.05）。将LX-1细胞条件培养基进一步用于培养QBC939细胞,用CXCL7过表达LX-1细胞条件培养基培养的QBC939细胞的增殖和侵袭性比对照组均有明显增加（P<0.05）。这些研究结果证实,CXCL7在胆管癌可能也以旁分泌依赖性方式发挥促进作用。3.胆管癌QBC939细胞AKT信号被CXCL7激活在本研究中,蛋白免疫印迹数据显示,与对照组相比,CXCL7沉默显著降低AKT信号活性（P<0.05）。相反,与对照组相比,胆管癌QBC939细胞CXCL7过表达能增强AKT信号活性（P<0.05）。根据这些数据,我们认为AKT信号激活参与CXCL7诱导的胆管癌细胞增殖和侵袭。结论综上所述,我们可以得出以下结论:（1）本研究表明在胆管癌细胞,CXCL7通过激活AKT信号通路对细胞增殖和侵袭发挥促进作用,（2）阻滞胆管癌与邻近组织的连接可能是治疗胆管癌的有效策略。