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目的检测信号转导及转录活化因子3(Signal transducer and activator of transcription 3,STAT3)、细胞周期素D1(CyclinD1)、细胞周期素B1(CyclinB1)、B细胞淋巴瘤/白血病基因-2(Bcl-2)在人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF中的表达,探讨STAT3,CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白在肺癌发病机制中的作用。方法1.细胞培养(cell culture):配置好细胞培养所需的各种液体后,复苏人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF,人肺腺癌细胞A549培养于含10%的小牛血清,100U/L青霉素,100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,正常人胚肺细胞HELF培养于含20%的胎牛血清,100U/L青霉素,100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,24h后见人肺腺癌细胞A549和正常人胚肺细胞HELF贴壁,说明复苏成功,继续传代培养,人肺腺癌细胞A549每2-4天传代一次,正常人胚肺细胞HELF每4-6天传代1次。2.裂解细胞提取蛋白:在每瓶细胞中加入300ul细胞裂解液,用枪尖吹打混匀,冰上裂解30min,离心4℃, 12000 rpm × 20min,收集上清蛋白。3.蛋白免疫印迹法(Western-blot):分别检测两组细胞中的Stat3,CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白:用BCA试剂盒测定样品总蛋白浓度、聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、考马斯亮蓝染色观察蛋白条带、电转移(electrotransfer)、封闭PVDF膜、免疫反应(加入一抗和二抗)、化学发光显示目的条带。4.图像分析:将Western-blot结果扫描传送至计算机,用Image-Proplus图像分析软件系统对蛋白条带进行分析,以蛋白条带的灰度值代表蛋白的表达量,用β-actin条带灰度值进行校正,得出各条带的相对灰度值。分析两组细胞中蛋白表达的差异以及在人肺腺癌细胞A549中Stat3蛋白与CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白表达的相关性。结果:1)人肺腺癌细胞A549中Stat3,CyclinD1,CyclinB1,Bcl-2蛋白的表达水平均明显高于正常人胚肺细胞HELF,Stat3蛋白在两组细胞的表达具有显著差异(P=0.037<0.05),CyclinD1在两组细胞中的表达有显著差异(P=0.019<0.05),CyclinBl在两组细胞的表达有显著差异(P=0.038<0.05),Bcl-2在两组细胞中的表达有显著差异(P=0.029<0.05)。2)经Person相关性分析显示:在人肺腺癌细胞A549中STAT3与CyclinDl表达呈线性相关(r==0.888,P=0.044<0.05);在人肺腺癌细胞A549中STAT3与Bcl-2表达呈线性相关(r=0.949,P=0.014<0.05);而在人肺腺癌细胞A549中STAT3与CyclinB1表达相关性无统计学意义(P=0.789>0.05)。
结论:1)Stat3蛋白在人肺腺癌细胞A549的表达水平均明显高于正常人胚肺细胞HELF,提示Stat3的过度表达可能在NSCLC的发病机制中发挥重要作用;2)CyclinD1蛋白在在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于正常人胚肺细胞HELF,提示CyclinD1的过度表达可能在NSCLC的发病机制中发挥重要作用;3)CyclinB1蛋白在人肺腺癌细胞A549的表达水平均明显高于正常人胚肺细胞HELF,提示CyclinB1的过度表达可能在NSCLC的发病机制中发挥重要作用;4)Bcl-2蛋白在人肺腺癌细胞A549中的表达水平均明显高于正常人胚肺细胞HELF,提示Bcl-2的过度表达可能在NSCLC的发病机制中发挥重要作用;5)在人肺腺癌细胞A549,Stat3蛋白的表达与CyclinD1蛋白的表达成线性相关,其可能机制是Stat3与Cyclin D1启动子上的Stat3位点结合而启动转录,促进癌细胞增殖而导致肺癌发生,由此可望寻找到NSCLC新的诊断方法和治疗靶点6)在人肺腺癌细胞A549中,Stat3蛋白的表达与Bcl-2蛋白的表达成线性相关,这表明Stat3在肺癌中的作用机制可能通过Bcl-2来实现,Stat3在肺癌中的表达增强,引起Bcl-2表达增强,从而引起肺癌的发生。7)在人肺腺癌细胞A549中,Stat3蛋白的表达与CyclinB1蛋白的表达无明显相关性。