目前,活体大动物研究表明,质粒DNA为基础的非病毒载体系统研究主要存在大量制备药用等级质粒费用高、质粒转染效率低和表达效率低等问题,阻碍了质粒DNA为基础的非病毒载体系统研究和开发。本文在中国农业大学农业生物技术重点实验室惠赠的pM-GHRH质粒基础上,进行了实验室质粒大量纯化研究。采用自制活体基因电转仪,以兔子为动物模型,研究骨骼肌电穿孔转绿色荧光蛋白基因。最后进行了绵羊、猪骨骼肌电穿孔转GHRH表达质粒的研究。结果概述如下。 ⑴采用简易设备,用曝气头向裂解液中喷曝空气进行菌体碱裂解后固液分离,将需要离心处理的浮杂层体积减少一倍,降低了劳动强度。 ⑵采用Fractogel(R) EMD TMAE(M)强阴离子交换介质分离纯化质粒DNA,该介质对质粒DNA的动态载样量达0.62 mg/mL,。用Triton X-114或Triton X-100预先处理质粒DNA的裂解澄清液后,经阴离子交换色谱分离纯化获得的质粒DNA中内毒素含量分别为6.42EU/mg和9.50EU/mg,显著低于未经Triton处理的裂解澄清液(67.82EU/mg)。 ⑶建立了非连续梯度阴离子色谱质粒DNA纯化步骤。用含500 mmol/L NaCl、50-mmol/L Tris、15％(体积分数)异丙醇和0.15％(体积分数)非离子表面活性剂的缓冲液(pH7.0)平衡色谱柱,将处理好的样品置于冰水浴中(0～4℃)用蠕动泵上样。然后用含625 mmol/L NaCl、50 mmol/L Tris和15％异丙醇的缓冲液(pH 7.0)淋洗色谱柱至基线走平。接着用1.25 mol/L NaCl-50 mmol/L Tris-15％异丙醇缓冲液(pH 8.5)洗脱色谱柱。线性流速120 cm/h。确定控制上样温度0-4℃是阴离子色谱结合Triton试剂有效纯化质粒DNA的关键。 ⑷采用本方法纯化的质粒DNA经质量检测,符合药用等级要求。该法实现了阴离子交换色谱一步纯化质粒DNA的目的,具有简便、省时、成本低等特点。 ⑸采用自制的活体基因电转仪进行了兔子骨骼肌电穿孔转绿色荧光蛋白表达质粒的实验。目测观察结果和组织切片结果初步显示,应用自行研制的活体基因电转仪进行兔子骨骼肌电穿孔转基因技术,提高了质粒在肌肉组织中的转染效率和表达水平。 ⑹在质粒纯化实验和兔子骨骼肌电穿孔转绿色荧光蛋白基因的定性实验基础上,进行了羔羊和仔猪骨骼肌电穿孔转GHRH表达质粒实验,动物体重变化结果表明,目前本实验构建的真核表达GHRH质粒结合电转染对羔羊和仔猪的生长没有显著影响。 本研究质粒纯化步骤中使用了动物源性酶RNase A,需要在今后的研究中解决,实现无动物源性纯化制备过程。兔子骨骼肌电穿孔转绿色荧光蛋白表达质粒实验初步证实自制的活体基因电转仪能够用于动物骨骼肌转基因研究,需要进一步优化电转染条件。动物骨骼肌电穿孔转GHRH表达质粒实验说明,本研究需要进一步优化GHRH表达质粒结构。使用质粒DNA技术改进全球食用动物的健康、福利及生产率的时代即将到来。本研究所进行的质粒纯化和质粒转染技术研究,将为以GHRH表达质粒为基础的实验研究乃至产业化推广提供参考。