论文部分内容阅读
目的:前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性肿瘤相关死亡的主要原因,对人类健康造成严重威胁。全基因组关联研究(Genome-Wide Association Study,GWAS)已经确定超过200个前列腺癌遗传风险位点,然而,研究者对这些位点发挥作用的生物学机制却知之甚少。本研究应用转座酶可及染色质测序技术(Assay for TransposaseAccessible Chromatin with High-Throughput sequencing,ATAC-seq),在全基因组范围内对前列腺癌发生过程中可能具有功能的调控区域进行定位,通过整合前列腺癌GWAS结果探索肿瘤风险相关的调控型功能位点,并结合生物信息学预测和生物学功能试验对其进行功能解读,旨在发掘真正具有功能的致病位点。方法:1.10对前列腺癌样本的ATAC-seq分析:利用ATAC-seq技术获得中国人群前列腺癌组织与对应正常组织的染色质开放概况,并进行差异分析,定位染色质开放状态改变的区域。2.差异开放区域内遗传变异的功能分析:染色质异常开放区域与全基因组范围注释的遗传变异进行位置比对,鉴定出差异开放区域内的遗传变异,并利用生物信息学数据库与表观遗传学特征对这些位点进行功能表征。3.靶基因的鉴定与分析:基于表达数量性状基因座(expression Quantitative Trait Loci,e QTL)和高通量染色质构象捕获(High-through Chromosome Conformation Capture,Hi-C)数据鉴定出差异开放区域内的遗传变异调控的靶基因,并利用通路富集分析对其功能进行探索。4.前列腺癌两阶段病例对照研究:对前列腺癌差异开放区域内遗传变异进行两阶段病例对照人群关联研究。发现阶段人群来源于db Ga P数据库,样本包含56 862个病例与39 543个对照;验证阶段使用中国人群样本,样本来源于武汉地区的1 152例病例和1 150例对照。5.目的位点及其靶基因的功能预测与生物学实验:针对关联最为显著的位点rs7077830开展生物学功能实验解读其功能机制,通过报告基因实验检测该位点所在区域的增强子活性,并通过细胞活力检测评价该位点所调控的靶基因NCOA4对前列腺癌细胞增殖活性的影响。结果:1.10对前列腺癌样本的ATAC-seq分析结果:本研究对采集的样本进行ATAC-seq,经质控和分析后,分别描述了前列腺癌组织和正常组织的染色质开放区域概况。通过差异分析,鉴定出有显著差异的染色质开放状态的区域。通过调控元件的富集分析,发现差异染色质开放区域显著富集于启动子、增强子、DNase I超敏位点区域和特征性组蛋白修饰区域,提示其在前列腺癌发生过程中可能具有重要功能。2.差异开放区域内遗传变异的功能表征结果:基于ATAC-seq数据和全基因组范围内遗传变异的位置比对鉴定出差异开放区域内的遗传变异。功能注释发现这些遗传变异富集于前列腺癌GWAS风险区域,转录因子富集分析进一步揭示了这些位点可以影响转录因子结合能力,发挥潜在调控作用。3.差异开放区域内遗传变异调控的靶基因分析结果:通过e QTL分析以及Hi-C数据鉴定出差异开放区域内的遗传变异所调控的靶基因,通路富集分析揭示了这些基因在前列腺癌发生过程中具有特异性生物学效应。4.前列腺癌两阶段病例对照研究:针对前列腺癌差异开放区域内的遗传变异,本研究通过两阶段病例对照研究探讨了其与人群前列腺癌易感性之间的关联,在发现阶段鉴定出差异开放区域内人群关联结果最显著的风险位点是rs7077830(OR=0.82,95%置信区间=0.82~0.84,P=2.2×10-76)。并在验证阶段的中国人群病例对照研究中对该位点进行独立验证,发现rs7077830[C]等位基因型携带者与前列腺癌患病风险降低显著相关(OR=0.84,95%置信区间=0.73~0.95,P=8.07×10-3)。5.rs7077830的生物学功能结果:表观遗传数据提示该位点所在区域具有活性调控元件特征。报告基因实验证实rs7077830[C]等位基因显著增加基因的转录,敲降和过表达转录因子后的报告基因实验揭示rs7077830等位基因特异性结合转录因子ZNF384,调控基因转录活性。e QTL分析和Hi-C数据提示rs7077830与NCOA4基因存在染色质交互作用,且该位点[C]等位基因型与前列腺组织NCOA4基因高表达相关(P=2.7×10-8)。6.靶基因NCOA4的生物学功能结果:差异表达分析显示,NCOA4基因在前列腺癌组织中表达下调。细胞活力检测证明过表达NCOA4能显著抑制前列腺癌细胞的增殖活性。结论:本研究通过对中国人群的前列腺癌组织和正常组织样本进行ATAC-seq,描述了前列腺癌组织和正常组织的染色质开放区域概况。差异分析确定了染色质开放状态差异区域,并通过全基因组遗传变异位置比对,鉴定出在前列腺癌差异开放区域内的潜在功能性遗传变异。使用病例对照研究发现人群关联结果最为显著的风险位点是rs7077830。结合生物信息学手段和功能实验证明了rs7077830通过等位基因特异性结合转录因子,影响染色质的开放状态,并调控在前列腺癌中发挥抑癌作用的NCOA4基因的表达水平,最终影响个体对前列腺癌的易感性。以上结果为前列腺癌病因研究提供线索,为发现前列腺癌新型标志物、实现个体化预防提供了科学依据。