【摘 要】
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社会人口老龄化越来越严重,衰老现已成为许多慢性病和破坏性疾病的主要危险因素。因此,进一步延缓衰老,使老龄化健康发展成为当下迫在眉睫的任务。树鼩作为一种遗传关系与灵长类较接近的小型实验动物,其脑-体重量比相对较大,神经发育与灵长类相似,近年来已被用于多项脑部及衰老相关疾病的研究。衰老细胞的积累是个体衰老的重要标志。细胞周期停滞是细胞衰老的重要特征,典型的细胞周期停滞标记物包括P16,P21和P53。
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社会人口老龄化越来越严重,衰老现已成为许多慢性病和破坏性疾病的主要危险因素。因此,进一步延缓衰老,使老龄化健康发展成为当下迫在眉睫的任务。树鼩作为一种遗传关系与灵长类较接近的小型实验动物,其脑-体重量比相对较大,神经发育与灵长类相似,近年来已被用于多项脑部及衰老相关疾病的研究。衰老细胞的积累是个体衰老的重要标志。细胞周期停滞是细胞衰老的重要特征,典型的细胞周期停滞标记物包括P16,P21和P53。UBE4B属于泛素结合因子E4家族中的一员,它与另一泛素连接酶（E3）、泛素（Ub）、泛素激活酶（E1）、泛素结合酶（E2）以及底物蛋白共同构成泛素化途径,参与细胞内蛋白质的翻译后修饰过程。UBE4 B能够靶向多种底物蛋白,包括p53,p63,p73,虾青素-3和表皮生长因子受体（E GFR）等。在DNA损伤应答中,肿瘤抑制因子（抑癌基因）P53被刺激后,会诱导P21的表达,产生细胞周期蛋白依赖性激酶（CDK）抑制剂,CDK活性受到抑制后导致细胞周期停滞,细胞进入衰老状态,多项研究表明,P53在衰老中发挥重要作用。然而,目前人们对细胞衰老的分子机制网络认识并不全面,需要进一步探究。前期研究提示树鼩 novel＿circRNA＿007362可能在衰老中发挥作用,但其具体机制不清楚。本研究对novel＿circRNA＿007362分子特征及其在组织和细胞中的表达进行了研究;对其与miRNA靶向调控关系及其作为tch-miR-98-5p和tch-let-7i-5p海绵对下游UBE4B 表达的调控展开研究;同时进行 了novel＿circ＿007362-tch-miR-98-5p/tch-let-7i-5p-UBE4B 通路对 P53 蛋白表达水平的调控和其在细胞衰老过程中的作用研究。研究结果显示:1、novel＿circRNA＿007362在幼年、青年、老年树鼩小脑中呈上升趋势,与RN A-seq测序结果一致,验证了测序结果的可靠性,而在海马组织中,变化趋势不明显。UBE4B的mRNA表达水平在各年龄段组织中也未见明显变化,novelcircRN A007362和UBE4B在各个年龄段树鼩的小脑组织中表达量均高于海马组织。在树鼩脑微血管内皮细胞中,随着细胞代次的增加,novel＿circRNA＿007362表达量先上升后下降,而UBE4B mRNA表达量则逐渐上升,两者间变化趋势不明显,需在后续实验中进一步探究两者间的调控关系。验证了 novel circRNA007362的环状结构,确定了其稳定存在于树鼩脑微血管内皮细胞中,且大部分存在于细胞质内,能够稳定发挥其功能,为后续的研究打下了良好基础。2、双荧光素酶报告实验验证了 novel＿circ＿007362和两个miRNA（tch-miR-98-5p,tch-let-7i-5p）均能够相互结合,存在靶向关系。并且,novel＿circ＿007362靶向tch-miR-98-5p预测到的两个结合位点发生突变都会导致荧光强度增高,两者的靶向结合减弱,表明预测的两个位点都是novel＿circ＿007362针对tch-miR-98-5p的靶向结合位点,并分别位于第1098-1105核苷酸和第1402-1409核苷酸。3、siRNA 干扰实验显示 novel＿circ＿007362 与靶向的 tch-miR-98-5p 和tch-let-7i-5p存在负调控关系;Western blot检测蛋白表达水平,发现siRNA转染48h后,细胞中的UBE4B蛋白表达量降低,并持续至72h,而P53蛋白在72h时表达量增加。同时,siRNA转染72h后,细胞变大扁平,细胞中β-半乳糖苷酶活性升高,表明细胞进入衰老状态。综上所述,新发现的树鼩novel＿circRNA＿007362能够通过作为tch-miR-98-5p和tch-let-7i-5p海绵,正向调控UBE4B的转录后翻译过程,间接负调控P53等抑癌基因的表达,影响细胞衰老进程。
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