论文部分内容阅读
目的:时间窗内重组组织纤溶酶原激活物（recombinant tissue plasminogen activator,rt-PA）溶栓及机械取栓是目前最有效的脑梗死急性期治疗方案,但即使在时间窗内进行溶栓或机械取栓治疗也不能确保患者获得良好预后,其中一个重要原因是血管再通后伴随的缺血再灌注损伤（ischemic reperfusion injury,IRI）导致血脑屏障（blood brain barrier,BBB）破坏,继而出现脑水肿、出血转化及神经炎症反应等严重并发症。BBB除了已知的细胞结构外,细胞外基质在维持BBB完整性及渗透性等功能上也起到重要作用。多糖包被（glycocalyx,Glx）作为细胞外基质的重要结构近年来备受关注,它是一层位于细胞表面富含多糖的结构。位于脑血管内皮细胞管腔面的Glx被认为是BBB的第一道防线。Glx的主要结构是由带负电荷的蛋白多糖、粘多糖和糖蛋白构成。蛋白多糖由核心蛋白与粘多糖链共价连接构成。核心蛋白主要包括多配体聚糖（syndecan,SYND）和磷酸酰基醇聚糖（glypican）,粘多糖主要包括硫酸软骨素（chondroitin sulfate,CS）和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate,HS）。另一种重要的粘多糖是透明质酸（hyaluronic acid,HA）,但它不附着在核心蛋白上,而是与HA受体相连接。Glx具有重要的生理功能,包括维持血管渗透性和血管内稳态、调节血流、机械传感、信号转导、防止白细胞与内皮细胞粘附、为生长因子和酶提供贮存空间等。在IRI的病理状态下,Glx被降解成片段并脱落到血液中。目前常用血液中HA、HS、SYND1的浓度变化来间接评估血管壁的完整性。因此,靶向干预Glx为IRI提供了一种可能的治疗策略。缺血预处理（ischemic preconditioning,IPC）对于IRI的神经保护作用在多项动物及细胞研究中得到证实,但其潜在机制尚不完全清楚。IPC根据干预部位可分为原位缺血预处理（in situ ischemic preconditioning,ISIPC）及远隔缺血预处理（remote ischemic preconditioning,RIPC）,前者对IRI的神经保护作用更强大,但由于其低可操作性和高风险性难以直接向临床转化。因此,探求其深层的神经保护机制并寻找适当的临床转化方式尤为重要。因此,本研究旨在探讨IPC是否通过干预Glx发挥神经保护作用。本研究建立大鼠大脑中动脉栓塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型,给予大脑中动脉原位缺血预处理（以下简称为IPC）。本研究在动物实验部分探讨以下问题:（1）IPC的神经保护作用;（2）IRI对Glx的影响,及IPC是否通过干预Glx发挥神经保护作用;（3）IPC干预Glx的细胞和分子机制。在临床研究中进一步验证动物实验中的结论。研究方法:动物实验分成两部分,在实验1中,Sprague-Dawley（SD）大鼠随机分为假手术组（Sham组,18只）、缺血再灌注损伤组（IRI组,30只）及缺血预处理+缺血再灌注损伤组（IPC+IRI组,30只）。在实验2中,将SD大鼠随机分入Sham组（30只）、IRI组（63只）及IPC+IRI组（57只）,每一组又随机分为2 h、6 h、1 d、2 d、3 d、7 d共6个相互独立的时间点亚组。1.探讨IPC的神经保护作用在实验1中,采用神经功能缺损评分量表来评估神经功能缺损;2,3,5-三苯基氯化四氮唑（2,3,5-Triphenyl tetrazolium chloride,TTC）染色评估梗死体积;干湿法评估脑组织水含量;苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色评估神经组织水肿情况;原位末端转移酶标记技术（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP-biotin nick end labeling,TUNEL）染色评估神经细胞凋亡情况;蛋白质印迹法（western blot,WB）评估血脑屏障紧密连接蛋白表达水平,免疫荧光染色评估星形胶质细胞及小胶质细胞增殖活化情况。2.探讨IPC是否通过干预Glx发挥神经保护作用该部分血液标本来自两部分实验。在实验1中,每个实验对象采集术前15 min、术后6 h和3 d这3个时间的血液标本,采用酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）试剂盒检测HS、HA、SYND1、基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase,MMP-2）、可诱导型一氧化碳合酶（inducible nitric oxide synthase,i NOS）浓度。并分析i NOS、MMP-2与HS、HA、SYND1的相关性。在实验2中,每一个实验对象在术前15 min及所在亚组对应时间点采集血样,通过ELISA试剂盒检测上述血液指标浓度。并评估血液指标与行为学缺损评分和脑组织水含量的相关性。3.IPC干预Glx的分子和细胞机制利用实验1中脑组织标本,采用逆转录-聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）检测MMP-2及i NOS的m RNA水平;WB检测MMP-2、i NOS、乙酰肝素酶（heparanase,HPSE）、透明质酸酶-1（hyaluronidase-1,Hyal-1）、透明质酸合酶-1（Hyaluronate synthase-1,HAS-1）的蛋白水平;采用免疫荧光染色将MMP-2、HAS-1和Hyal-1分别与神经元标志物Neu N、星形胶质细胞标志物GFAP、小胶质细胞标志物Iba-1或血管内皮细胞标志物CD31共染,以确定其在不同细胞中的表达情况。4.临床研究探讨行机械取栓的前循环AIS患者血液Glx组分及影响因子变化趋势及与临床预后的关系本研究为单中心、前瞻性临床实验,研究对象为北部战区总医院2022年1月1日至2022年3月31日入院的40例行机械取栓治疗的前循环AIS患者及10例与之基线资料相匹配的非急性脑梗死对照患者。入组患者均需要签署知情同意书,完成基线资料、临床资料,梗死组患者采集术前15 min、术后2 h、24 h及3 d的血液样本,对照组采集一次入院时血液标本。血液样本行ILISA检测HA、HS、SYND1、MMP-2、i NOS浓度。终点事件包括早期神经功能改善（early neurological improvement,ENI）和90天m RS。结果:1.与IRI组相比,IPC+IRI组大鼠行为学缺损评分降低,梗死体积及神经细胞凋亡减少,脑水肿、神经组织水肿和BBB破坏减轻,增加反应性星形胶质细胞数量、减少活化小胶质细胞数量;2.实验1血液结果示,Sham组HA、HS、SYND1、i NOS和MMP-2比率（术后浓度/术前浓度）均未随时间发生变化;IRI组HA、SYND1和MMP-2比率于术后6 h及3 d时升高,HS、i NOS比率升高于术后3 d升高。IPC促进3 d时HA、MMP-2比率升高,抑制3 d时HS、i NOS比率升高。相关性分析结果示,MMP-2比率与HA、SYND1比率呈正相关,i NOS比率与HS比率呈正相关。实验2血液结果示,与Sham组相比,IRI组在术后2 h～7 d的HA、SYND1、MMP-2比率升高,在2 d、3 d时HS、i NOS比率升高。与IRI组相比,IPC+IRI组增加6 h～3 d的HA比率及3 d时MMP-2比率,降低2 d、3 d时HS、i NOS比率。相关性分析结果示,HA比率与脑水肿、行为学缺损评分呈负相关。3.在术后第3 d,IRI下调HAS-1及上调Hyal-1蛋白水平,与之相比,IPC上调HAS-1和下调Hyal-1蛋白水平。IRI组上调MMP-2和i NOS的m RNA及蛋白水平;与之相比,IPC上调MMP-2,下调i NOS的m RNA及蛋白水平。免疫荧光结果示,与IRI组相比,IPC组通过促进星形胶质细胞和神经元表达HAS-1,抑制小胶质细胞和血管内皮细胞表达Hyal-1,双向调节MMP-2,进而发挥对HA代谢的调节作用。4.行机械取栓的AIS患者血液中HA、HS、SYND1、MMP-2、i NOS的术前浓度与对照组无差异,术后2 h、24 h、3 d呈持续上升趋势;梗死组患者按血液指标2 h浓度比率的中位数分为高比率组与低比率组,结果示HA高比率组ENI发生率较低比率组升高,余指标未见与功能预后相关。结论:1.IPC从多个方面发挥神经保护作用,例如减少脑梗死,减轻脑水肿及调节卒中后神经炎症反应;2.IRI导致脑组织Glx破坏并脱落至血液中,且其破坏与MMP-2和i NOS相关,IPC对Glx组分存在选择性干预。IPC可能通过增加血液中HA比率减轻脑水及行为学缺损评分。3.IPC组通过促进星形胶质细胞和神经元表达HAS-1,抑制小胶质细胞和血管内皮细胞表达Hyal-1,双向调节MMP-2,发挥对HA代谢的调节作用。4.行机械取栓的前循环AIS患者术后2 h、24 h、3 d血液中HA、HS、SYND1、MMP-2、i NOS浓度呈持续升高趋势,且2 h-HA比率升高与ENI相关。