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目的:牙周炎是以菌斑生物膜为始动因子发生在牙周支持组织的慢性感染性疾病。口腔上皮作为抵御病原体入侵牙周组织的第一道防线,口腔上皮细胞连接发挥重要核心作用。在牙周炎症状态下,牙周致病菌可通过破坏上皮细胞连接侵入牙龈及深层组织。牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)作为关键牙周致病菌,通过多种途径破坏上皮连接,侵入上皮屏障,加剧牙周组织破坏。因此,深入探讨P.gingivalis感染破坏口腔上皮连接机制对牙周炎的病因学研究具有重要意义。铁是保证几乎所有生物体生存所必需的微量金属元素,参与氧气运输、DNA合成、细胞呼吸、能量代谢等多种重要功能。作为生命体的重要代谢途径之一,铁代谢稳态对机体维持正常生理功能至关重要,铁代谢异常能够引起病理改变。铁超载能够导致活性氧累积,触发氧化应激、脂质过氧化甚至DNA损伤。同时,铁元素是P.gingivalis存活所必需的外源性元素,P.gingivalis能够摄取铁和储存铁。研究表明P.gingivalis可通过合成并分泌蛋白酶摄取宿主细胞铁蛋白中的铁元素,从而影响宿主细胞铁代谢。本课题组前期研究提示P.gingivalis感染可能诱导口腔上皮细胞铁代谢异常介导细胞上皮连接的破坏,导致牙周破坏进一步加剧。然而,铁代谢异常对口腔上皮屏障影响的相关研究鲜有报道。基于以上研究背景,本研究结合生物信息学手段筛选铁代谢相关分子、通过动物实验结合体外实验检测上皮连接与铁代谢相关蛋白表达水平,建立口腔上皮细胞感染模型,探索P.gingivalis感染导致口腔上皮细胞铁代谢异常引起细胞上皮连接破坏的分子机制,并通过转录组测序筛选获得调控铁代谢的潜在分子,旨在深入探究牙周炎发生发展的分子机制,为进一步提供牙周炎的临床治疗靶点提供新思路。研究方法:本研究主要分为以下三个部分:第一部分:(1)从基因表达数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)中筛选符合条件的临床牙周炎牙龈组织基因表达数据集,通过文献查阅和检索数据库获得上皮连接和铁死亡相关基因集合数据,分析获得牙周炎组织中上皮连接以及铁代谢相关差异表达基因,应用Spearman相关性分析明确上皮连接和铁代谢基因之间的相关性。(2)通过建立大鼠实验性牙周炎模型,苏木素-伊红染色和Micro-CT检测判定大鼠牙周组织炎症水平,免疫组织化学染色检测大鼠健康牙龈组织和炎症牙龈组织中上皮连接相关蛋白,闭合蛋白(Occludin,OCLN)、钙黏蛋白1(Cadherin 1,CDH1)、闭锁小带蛋白1(Zonula occludens 1,ZO-1)以及铁代谢相关蛋白,铁蛋白轻链(Ferrtin light chain,FTL)、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase 4,GPX4)的分布和表达。第二部分:分别构建P.gingivalis ATCC 33277或戈登链球菌(Streptococcus gordonii,S.gordonii)菌株S.gordonii Challis CH1感染口腔上皮细胞的体外模型。通过铁螯合剂(Deferoxamine,DFO)干预口腔上皮细胞铁代谢水平,明确P.gingivalis感染对上皮连接相关蛋白表达的影响。应用(1)CCK8法检测细胞增殖能力;(2)透射电镜观察细胞超微结构,观察线粒体形态变化;(3)流式细胞术检测细胞内脂质过氧化水平;(4)荧光探针检测细胞内铁离子水平;(5)ELISA法检测胞内谷胱甘肽含量;(6)蛋白免疫印迹(western blot)方法检测细胞中上皮连接相关分子闭合蛋白(OCLN)、钙黏蛋白(CDH1)以及铁代谢相关分子铁蛋白轻链(FTL)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)、溶质载体1家族7成员11(Solute carrier family 7 member 11,SLC7A11)的蛋白表达水平。第三部分:(1)建立P.gingivalis感染口腔上皮细胞模型,对实验组和对照组样本进行转录组测序,筛查P.gingivalis感染口腔上皮细胞过程中引起铁代谢异常的关键调控分子,实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)验证筛选分子的表达。(2)应用si RNA抑制关键调控分子转录因子髓细胞组织增生病毒癌基因(MYB proto-oncogene,MYB)表达,通过qRT-PCR检测细胞膜转运体SLC7A11、谷胱甘肽过氧化物酶GPX4的基因表达水平,western blot技术检测上皮连接相关分子钙黏蛋白1(CDH1)、闭合蛋白(OCLN)与铁代谢相关分子细胞膜转运体(SLC7A11)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX4)的蛋白表达水平,以明确MYB与SLC7A11和GPX4间的调控关系。(3)通过转染si-MYB及应用谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂,构建MYB沉默回复模型,western blot方法检测上皮连接蛋白钙黏蛋白1(CDH1)、闭合蛋白(OCLN)的蛋白表达水平,进一步明确MYB/SLC7A11/GPX4轴在P.gingivalis感染口腔上皮细胞破坏上皮连接过程中的分子调控机制。结果:第一部分研究发现:(1)借助生物信息学手段分析显示牙周炎牙龈组织中上皮连接关键分子为钙黏蛋白、闭合蛋白、闭锁小带蛋白,与铁代谢相关的关键分子谷胱甘肽过氧化物酶、铁蛋白具有密切相关性(|r|>0.5);(2)大鼠牙周炎牙龈组织中上皮连接蛋白钙黏蛋白、闭合蛋白、闭锁小带蛋白及与铁代谢相关蛋白谷胱甘肽过氧化物酶的表达水平较对照组均显著降低,铁蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。第二部分研究发现:(1)口腔上皮细胞经高感染复数P.gingivalis感染12 h以上,细胞增殖能力受到抑制(P<0.05);(2)P.gingivalis感染后口腔上皮细胞线粒体发生铁死亡形态学改变;(3)流式细胞术结果表明,P.gingivalis感染能够提高口腔上皮细胞胞内脂质过氧化水平,铁离子螯合剂(DFO)干预显著减弱P.gingivalis感染引起的脂质过氧化水平异常升高程度(P<0.05);(4)荧光探针结果显示,P.gingivalis感染能够促进口腔上皮细胞胞内及线粒体Fe2+含量升高,DFO干预显著减弱Fe2+含量的异常升高程度(P<0.05);(5)ELISA检测结果表明P.gingivalis感染能够降低口腔上皮细胞的谷胱甘肽水平,DFO干预减弱P.gingivalis感染引起的谷胱甘肽水平降低程度(P<0.05);(6)蛋白免疫印迹结果显示,P.gingivalis 24 h短时感染模型中,促铁代谢分子表达水平升高,抑制铁代谢分子表达水平降低,上皮连接蛋白表达水平降低(P<0.05);(7)对比P.gingivalis或S.gordonii感染口腔上皮细胞的模型,P.gingivalis的感染模式具有特异性,S.gordonii感染导致上皮连接蛋白表达水平升高抑制铁代谢;P.gingivalis感染导致上皮连接蛋白表达水平降低促进铁代谢(P<0.05),表明P.gingivalis感染能够特异性导致口腔上皮细胞发生铁代谢异常和上皮连接减弱。第三部分研究发现:(1)转录组测序筛查结果显示差异表达的转录因子中TWIST1、SOX4、SMAD3、MYB、P53高表达,且MYB表达差异最为显著(FC=2.387,P<0.05);(2)沉默MYB后,SLC7A11、GPX4的m RNA及蛋白表达水平显著升高(P<0.05),上皮连接蛋白钙黏蛋白1(CDH1)、闭合蛋白(OCLN)的蛋白表达水平显著升高(P<0.05),提示MYB能够有效抑制SLC7A11与GPX4表达,且MYB对口腔上皮连接分子的表达具有抑制作用;(3)GPX4抑制剂可显著减弱si-MYB引起的钙黏蛋白、闭合蛋白表达升高程度(P<0.05),提示谷胱甘肽过氧化物酶能够一定程度阻碍MYB对口腔上皮连接分子表达的抑制作用。综合本研究结果,推测P.gingivalis可能通过MYB/SLC7A11/GPX4途径介导铁代谢异常促进口腔上皮细胞连接破坏。结论:1、P.gingivalis感染能够引发口腔上皮铁超载和上皮连接破坏。2、铁螯合剂一定程度上能够减弱P.gingivalis引发的口腔上皮细胞铁代谢异常程度,恢复上皮连接。3、相较于口腔链球菌代表株S.gordonii,P.gingivalis诱导口腔上皮细胞发生铁代谢异常及上皮连接减弱具有特异性。4、P.gingivalis可能通过MYB/SLC7A11/GPX4途径介导铁代谢异常促进口腔上皮细胞连接破坏。