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目的:牙周炎(periodontitis)是由牙菌斑生物膜引起的牙周组织慢性感染性疾病,牙周炎症引起牙槽骨的吸收,牙周袋形成及牙齿松动脱落,是成人丧失牙齿的主要原因。牙菌斑生物膜是牙周炎的始动因素,其中革兰阴性厌氧菌在牙周炎中发挥重要作用,牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis)是牙周炎主要的优势菌之一,是目前公认的牙周重要致病菌。P.gingivalis通过多种机制干扰宿主的防御能力,导致牙周结缔组织的破坏和牙槽骨的吸收。正常的牙槽骨骨代谢活跃,牙槽骨功能依靠成骨细胞的骨生成和破骨细胞的骨吸收间动态平衡,当牙周炎发生时,这种动态平衡被打破,成骨细胞的骨形成作用受到抑制,破骨细胞的骨吸收功能不断增强,最终导致牙槽骨的不断吸收和破坏。促红细胞生成肝细胞激酶(Erythropoietin producing hepatocyte kinases,Eph)受体是酪氨酸激酶受体家族中的一员,它可与其配体促红细胞生成肝细胞激酶受体相互作用蛋白(Erythropoietin producing hepatocyte kinases receptor interacting protein,Ephrin)结合后产生双向信号传导,参与调节多种细胞生物学过程。研究发现,位于成骨细胞的EphB4受体和破骨细胞的EphrinB2配体是骨形成与骨吸收作用中重要的耦联调节因子,破骨细胞中的EphrinB2配体激活成骨细胞的EphB4受体为正向传导信号,促进成骨细胞骨形成作用,成骨细胞的EphB4受体激活破骨细胞的EphrinB2配体为反向传导信号,抑制破骨细胞的骨吸收活动,当EphB4/EphrinB2信号被阻断后,将降低成骨细胞的活性,促进了破骨细胞的分化,最终影响成骨细胞和破骨细胞分化相关转录因子和蛋白表达。EphB4/EphrinB2双向信号传导在维持骨质平衡和调节骨改建过程中发挥重要作用。因此,基于以上研究背景,本实验利用P.gingivalis构建大鼠牙周炎模型,对EphB4/EphrinB2在牙周炎组织和正常组织中的存在情况进行了验证,并试图通过建立P.gingivalis感染成骨细胞和破骨细胞模型,探究P.gingivalis对EphB4/EphrinB2信号通路的作用及可能涉及的分子机制。研究方法:1.将大鼠上颌第一磨牙结扎和牙龈周围涂P.gingivalis建立牙周炎感染模型,通过扫描Micro-CT,测量釉牙骨质界到牙槽嵴顶(CEJ-ABC)的距离,观察牙槽骨吸收情况,应用苏木素伊红染色方法观察大鼠牙槽骨周围炎症情况,采用免疫组织化学法检测EphB4、EphrinB2的表达。2.成骨诱导液培养MC3T3-E1前体成骨细胞为成骨细胞,通过Western-blot及免疫荧光方法检测MOI=100 P.gingivalis感染成骨细胞后,EphB4、成骨细胞活性因子Runx2、ALP和OPN蛋白表达。3.诱导RAW264.7细胞为破骨细胞,通过Western-blot及免疫荧光方法检测MOI=100 P.gingivalis感染破骨细胞后,EphrinB2、破骨细胞活性因子C-fos、NFATc1和Cts K蛋白表达。4.为明确EphB4在成骨细胞中的作用,采用siRNA沉默和质粒过表达EphB4,建立成骨细胞加入EphrinB2-Fc蛋白模拟共培养体系,检测P.gingivalis感染共培养体系后,EphB4、成骨活性因子Runx2和ALP蛋白表达。5.为明确EphrinB2在破骨细胞中的作用,采用siRNA沉默和质粒过表达EphrinB2,建立破骨细胞加入EphB4-Fc蛋白模拟共培养体系,检测P.gingivalis感染共培养体系后,EphrinB2、破骨活性因子C-fos、NFATc1和Cts K蛋白表达。结果:1.动物实验研究结果Micro-CT显示,随着感染时间的增加(4 w、6 w和10 w),应用P.gingivalis组牙槽骨吸收高于对照组(P﹤0.05);HE结果显示,牙周组织炎症逐渐加重;免疫组化结果显示,牙周炎组织中EphB4和EphrinB2的表达高于对照组(P﹤0.05),但随着P.gingivalis感染时间的延长,EphB4和EphrinB2的表达逐渐降低。2.当采用MOI=100 P.gingivalis感染成骨细胞或破骨细胞后,随着时间的增加,EphB4、成骨活性因子表达降低(P﹤0.05)。与对照组比较,P.gingivalis感染6 h、12 h、24 h时EphrinB2表达增高,而48 h时EphrinB2表达降低,破骨活性因子表达升高,24 h最为明显(P﹤0.05)。3.当成骨细胞中加入EphrinB2-Fc蛋白模拟共培养体系后,q PCR和Westernblot检测显示,siRNA转染抑制EphB4表达后,成骨活性因子表达降低(P﹤0.05);应用质粒过表达EphB4后,成骨活性因子表达升高(P﹤0.05),表明P.gingivalis能够抑制EphB4表达。4.当破骨细胞中加入EphB4-Fc蛋白模拟共培养体系后,q PCR和Western-blot检测显示,siRNA转染抑制EphrinB2表达后,破骨活性因子表达升高(P﹤0.05),应用质粒过表达EphrinB2后,破骨活性因子表达降低(P﹤0.05),表明P.gingivalis能够抑制EphrinB2表达。结论:1.在大鼠牙周炎的发展过程中,随着感染时间的增加,应用P.gingivalis组牙槽骨吸收增多,牙周组织炎症逐渐加重;EphB4和EphrinB2的表达与对照组相比增高;但随着感染时间的延长,EphB4和EphrinB2表达逐渐降低。P.gingivalis感染后通过调控EphB4和EphrinB2,抑制成骨细胞,促进破骨细胞功能。EphB4和EphrinB2可能参与牙周炎发展过程中牙槽骨的改建活动。2.P.gingivalis分别感染成骨细胞和破骨细胞后,随着时间的增加,调节成骨细胞EphB4和破骨细胞EphrinB2蛋白表达,成骨细胞活性减弱,破骨细胞活性增强。3.通过建立EphrinB2-Fc蛋白与成骨细胞、EphB4-Fc蛋白与破骨细胞的模拟共培养体系,P.gingivalis感染抑制EphB4和EphrinB2,成骨细胞活性降低,破骨细胞活性增强,可能通过EphB4/EphrinB2双向信号传导发挥调控作用,影响骨稳态的失衡。