【摘 要】
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目的肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的癌症之一,也是癌症死亡的主要原因之一,我国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家。目前全球范围内肝癌的发病率仍呈上升趋势,而人们对肝癌发病机制的认识并不完整,临床上肝癌治疗的效果并不理想,死亡率仍居高不下。因此,急需寻找新的抑制肝癌的药物候选分子、并在分子水平揭示其杀伤肝癌细胞的机理,为研发更加有效的药物和设计更加合理的治疗方案提供实验数据支持和理论基础。本工
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目的肝细胞癌（HCC）是世界上最常见的癌症之一,也是癌症死亡的主要原因之一,我国是全球肝癌发病率最高和病死数最多的国家。目前全球范围内肝癌的发病率仍呈上升趋势,而人们对肝癌发病机制的认识并不完整,临床上肝癌治疗的效果并不理想,死亡率仍居高不下。因此,急需寻找新的抑制肝癌的药物候选分子、并在分子水平揭示其杀伤肝癌细胞的机理,为研发更加有效的药物和设计更加合理的治疗方案提供实验数据支持和理论基础。本工作是在前期研究的基础上,进一步揭示结晶紫（Gentian violet,以下简称GV）这一独特的非处方药物分子对肝癌的抑制作用及其分子机制。为这一颇具优势的药物在治疗肝癌方面的临床转化提供实验依据。方法1、在肝细胞癌细胞系SK-hep-1和SMMC-7721中,利用检测细胞存活率、流式细胞检测凋亡标记等方法确定GV对HCC细胞的杀伤及诱发凋亡作用;用生长曲线、克隆形成实验、划痕实验、侵袭实验确定GV对肝癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响。2、对用结晶紫处理后HCC细胞系SK-Hep-1的转录组数据进行信号通路富集分析,筛选结晶紫在HCC细胞中发挥杀伤作用的关键信号通路;3、通过研究铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）对GV所诱发的HCC细胞死亡及抑制增殖/迁移/侵袭效应的挽救作用,确定GV在HCC中诱发铁死亡;4、利用si RNA沉默、流式细胞检测、RT-PCR、Western Blot等方法揭示在GV作用下所诱发铁死亡信号通路的关键蛋白;5、建立裸鼠HCC荷瘤模型,确定结晶紫对体内肝癌肿瘤生长的影响,并检测关键蛋白在瘤体组织中的表达;6、利用TCGA数据库筛选肝癌的铁死亡相关预后基因并构建多基因预后模型。结果1、结晶紫在SK-hep-1和SMMC-7721细胞中,具有显著的剂量依赖性的杀伤作用,以及抑制增殖、迁移及侵袭的作用。GV可诱发凋亡;2、在SK-Hep-1细胞系中,对结晶紫处理组的转录组数据差异基因及信号通路富集分析显示,结晶紫的作用可能与激活铁死亡信号通路相关;3、铁死亡抑制剂Fer-1对GV抑癌作用的部分挽救:即Fer-1可减少GV对HCC细胞的杀伤率、减轻对HCC的增殖、迁移及侵袭的抑制作用,说明在GV诱发的HCC死亡现象中,除凋亡外也包括铁死亡;4、GV可同时增强泛素连接酶MDM2和抑癌蛋白p53的表达,提示在GV作用下MDM2和p53负反馈回路的分离和GV-p53/MDM2-铁死亡信号轴的建立。5、小鼠成瘤实验结果显示,GV可抑制肝癌肿瘤生长,且抑制肿瘤效果随着给药浓度加大而增强,小鼠对治疗剂量的GV耐受性良好。免疫组化结果显示GV可增强瘤体组织中MDM2和p53的表达。6、通过TCGA数据库中肝癌铁死亡的生物信息分析,构建了多基因预后风险模型,构建了整合风险模型和临床特征的诺模图,对肝癌患者的生存结局进行了量化。结论结晶紫具有显著的对肝细胞癌的杀伤作用、对增殖/生长/迁移及侵袭的抑制作用、以及动物全身用药下的抑癌作用。GV对HCC的杀伤既包括凋亡也包括铁死亡。诱发铁死亡的分子机制与增强MDM2和抑癌蛋白p53表达、建立GV-p53/MDM2-铁死亡信号轴有关。铁死亡相关基因的分析可建立对患者生存结局量化的模型。本工作使GV研究达到从“体外实验到动物实验”、从“局部外用到全身用药”的推进;为这一颇具优势的药物在治疗肝细胞癌方面的进一步研究提供实验依据。
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