论文部分内容阅读
缢蛏（Sinonovacula constricta）是我国四大养殖贝类之一,因肉多味鲜深受大众喜爱,是重要的经济贝类。近年来,缢蛏人工育苗技术已被突破,但是产卵机制尚不清楚。缢蛏与其它双壳贝类不同,即使在白天采用升温、阴干、流水刺激、降低盐度、遮光等催产手段均无效,产卵时间严格限定在夜间,推测缢蛏产卵可能受环境因子之外的内源生物钟的严格调控。为探讨生物钟对缢蛏夜间产卵的调控机制,本研究通过测量缢蛏摄食率、心率和性激素的昼夜变化,初步确定缢蛏的生活方式及性激素是否存在昼夜节律变化;基于成熟卵巢的转录组分析鉴定与产卵相关的节律基因和生物钟基因;克隆获得关键生物钟基因Bmal1和Period的c DNA全长序列,并利用q RT-PCR、Western blotting、免疫荧光技术、si RNA技术研究Bmal1和Period基因与缢蛏产卵的相关性。本研究通过关键生物钟基因与生理指标、性激素的关联分析,旨在初步探讨生物钟调控缢蛏夜间产卵的生理和分子机制,这将对其它贝类产卵分子机制研究和工厂化育苗育种实践具有重要应用价值和借鉴意义。1.利用无损伤性心跳红外监测仪实时跟踪测量缢蛏雌、雄个体72 h心率变化。结果发现缢蛏雌、雄的心率均是夜间20:00-04:00高于白天,存在昼夜规律变化,初步推测缢蛏是夜行性动物;利用血球计数板计数缢蛏昼夜摄食牟式角毛藻（Chaetoceros musculi）的颗粒数,结果显示缢蛏的摄食在72 h内均在夜间00:00-02:00和06:00-08:00时间段高于白天12:00-14:00和18:00-20:00,并存在夜高昼低的显著差异（P＜0.05）;利用ELISA技术检测了缢蛏繁殖期卵巢/精巢72 h内昼夜不同时间（00:00、06:00、12:00和18:00）性激素含量变化,结果表示卵巢雌二醇和精巢睾酮含量均是在00:00最高,18:00最低,呈现先降低再升高的昼夜变化规律（P＜0.05）。本实验发现缢蛏的摄食、心率均存在昼夜节律变化规律,表示生物钟可能调控了缢蛏的多个生命活动,同时性激素的昼夜规律性变化进一步表明生物钟可能参与缢蛏的夜间产卵。2.利用高通量RNA-Seq测序技术对缢蛏繁殖盛期的卵巢组织进行昼（12:00和18:00）/夜（00:00和06:00）转录组测序分析,共筛选得到3379个DEGs。通过GO富集、KEGG显著富集分析,鉴定出与产卵相关的Gn RH信号通路、Wnt信号通路、TGF-β信号通路等;在转录组文库中筛查到了关键生物钟基因Bmal1、Period、Timeless等;利用q RT-PCR技术研究了卵巢生物钟基因（ROR、Timeless）和与产卵相关节律基因（EGR3、DHCR7、STS、cyp19、WNT、SRD5A）在缢蛏5个组织（卵巢、精巢、鳃、肝胰腺、水管）昼夜不同时间（00:00和12:00）的表达分析,结果显示在5种组织中,基因ROR、EGR3和STS表达量均在00:00高于12:00;Timeless、DHCR7、cyp19、WNT和SRD5A表达量均在12:00高于00:00（P＜0.05）;对关键生物钟基因Bmal1和Period进行连续72 h的昼夜时间表达,结果表示Bmal1和Period均具有稳定的昼夜节律表达。本实验发现了多个与缢蛏产卵相关的KEGG通路和卵巢生物钟基因、节律基因,表明生物钟存在于缢蛏的卵巢组织中,并可能参与调控缢蛏的夜间产卵活动。3.利用RACE克隆技术获得Bmal1、Period基因的c DNA全长序列,Bmal1基因的c DNA全长为1944 bp,编码647个氨基酸;Period基因的c DNA全长为3327 bp,编码1108个氨基酸。Bmal1基因在缢蛏5种组织（卵巢、精巢、鳃、肝胰腺、水管）中的表达量均是夜间00:00-06:00高,白天12:00-18:00低;而Period基因在鳃组织中的表达量与Bmal1基因表达一致,其余组织中的Period基因表达与Bmal1基因表达趋势截然相反,均是在白天12:00-18:00高,夜间的00:00-06:00低。蛋白水平上,Bmal1和Period蛋白含量变化均是比m RNA水平延迟6 h-12 h,且均是在成熟卵母细胞、精子细胞、肝胰腺中的肝细胞、鳃丝边缘和水管末端边缘的上皮细胞中荧光信号强。si RNA干扰结果表明Bmal1、Period基因均是在第5d干扰效率达到最高（P＜0.01）,其蛋白表达量变化与m RNA水平基本一致。生化水平上,本研究测定了Bmal1、Period基因在si RNA干扰后精巢的睾酮和卵巢的雌二醇含量变化,结果发现睾酮和雌二醇含量在干扰后1 d至9 d均显著下降（P＜0.01）。综合表明,缢蛏Bmal1、Period基因存在于多个组织中,且在昼夜不同时间的表达趋势截然相反,表明缢蛏的Bmal1和Period基因可能分别参与了生物钟调控的正反馈和负反馈通路,联合其它生物钟基因形成一个24 h的昼夜节律调控机制;si RNA干扰结果表明生物钟基因Bmal1、Period可能通过调控性激素的分泌进而参与缢蛏的夜间产卵过程。