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【目的】本课题采用转化生长因子-β1(TGF-β1)诱导体外培养人肾小管上皮细胞(HK-2)转分化构建肾间质纤维化细胞模型,通过姜黄素(Cur)干预TGF-β1诱导人肾小管上皮细胞增殖、表型转化、细胞外基质成分合成以及TGF-β/Smad信号转导途径的实验研究,探讨姜黄素干预肾间质纤维化的作用及机制,为其防治肾间质纤维化的临床应用提供实验依据。【方法】HK-2细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素DMEM/F12(1:1)完全培养基,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养。每隔2-3天换新鲜培养基一次,培养融合至80%以上,用含0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA的消化液消化,用完全培养基终止消化后,离心5 min(1000g/min)。用新鲜培养基将细胞重悬后进行传代培养。实验前先用无血清培养基培养24h使细胞同步化。实验分为以下5组:空白对照组(DMEM/F12培养液)、单纯TGF-β刺激组(DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1)、低浓度药物处理组(DMEM/F12培养液+10 ng/mL TGF-β1+1μmoL/L Cur)、中浓度药物处理组(DMEM/F12培养液+10ng/mL TGF-β1+5μmoL/L Cur)、高浓度药物处理组(DMEM/F12培养液+10 ng/mLTGF-β1+10μmoL/L Cur)。然后进行下列实验研究:(1)通过倒置显微镜下观察细胞形态、MTT法检测细胞增殖,探讨姜黄素对细胞增殖的干预作用;(2)通过免疫细胞化学法检测α-SMA、E-cadherin的表达,探讨姜黄素对细胞表型转化的干预作用;(3)通过ELISA法检测细胞培养上清ColⅠ、ColⅢ、FN的含量,以及RT-PCR法检测细胞ColⅠ、ColⅢmRNA的表达,探讨姜黄素对细胞外基质成分合成的干预作用;(4)通过Western blot法检测TβRⅠ、TβRⅡ、smad2、Smad 3、P-Smad 2/3以及smad 7蛋白表达,探讨姜黄素对TGF-β/Smad信号转导途径的干预作用。【结果】(1)姜黄素对细胞增殖的干预作用倒置显微镜下观察发现,正常HK-2细胞呈立方形铺路石样贴壁生长,当培养液中加入TGF-β1作用24h后,细胞拉长增大呈梭形,细胞间隙加大,具有纤维样特征,与姜黄素共同作用后,细胞形态随着姜黄素浓度的增加在一定程度上趋向于正常形态。MTT比色结果显示:TGF-β1能够诱导HK-2细胞增殖,与空白对照组相比有显著性差异(P<0.05),但和姜黄素共同作用后,其促细胞增殖作用受到显著抑制(P<0.05)。(2)姜黄素对细胞表型转化的干预作用免疫细胞化学实验结果显示:正常HK-2细胞胞膜强烈表达E-cadherin,几乎没有α-SMA表达,经TGF-β1诱导后胞浆强烈表达α-SMA,E-cadherin表达几乎消失,但与姜黄素共同作用后α-SMA表达明显减弱,E-cadherin表达显著增强。(3)姜黄素对细胞外基质成分合成的干预作用ELISA实验结果显示:HK-2细胞经TGF-β1处理24h、48h、72h后,时间依赖性地促进ColⅠ、ColⅢ、FN的分泌(p<0.05),但经姜黄素干预后ColⅠ、ColⅢ、FN的分泌均受到显著抑制(p<0.05)。并且RT-PCR实验结果显示,姜黄素也能抑制ColⅠ、ColⅢmRNA的表达。(4)姜黄素对TGF-β/Smad信号转导途径的干预作用Western blot实验结果显示:HK-2细胞经TGF-β1作用24h后,TβRⅠ、TβRⅡ、smad2、Smad 3、P-Smad 2/3蛋白表达显著增强,smad7蛋白表达显著减弱,与空白对照组相比有显著性差异(p<0.05),但和姜黄素共同作用后,TβRⅠ、TβRⅡ、smad2、Smad 3、P-Smad 2/3蛋白表达受到抑制,而smad7蛋白表达增强,与单纯TGF-β1作用相比有显著性差异(P<0.05)。【结论】姜黄素能够抑制肾小管上皮细胞增殖,阻止肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转分化,并能减少细胞外基质成分的合成,阻断TGF-β/Smad信号转导途径,具有干预肾间质纤维化的作用,为肾间质纤维化的临床治疗提供了实验依据。