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水蛭作为活血化瘀药材的一种,临床上常用于治疗心血管疾病,并且疗效显著。本实验室经过多年研究采用可控酶解技术,制备获得低分子量的水蛭酶解物,具有抗凝血、防治中风和抗动脉粥样硬化的作用。本课题建立在前期研究基础之上,通过体外构建动脉粥样硬化病理特征性细胞——泡沫细胞,观察水蛭酶解物对泡沫细胞形成的抑制作用,并进一步探讨其作用机制。论文主要内容如下：1.构建泡沫细胞采用80μg/ml的oxLDL作用于巨噬细胞系24h后形成泡沫细胞。并对模型细胞进行油红O染色和胆固醇含量测定进行验证,油红O染料染色结果显示oxLDL可以诱导RAW246.7巨噬细胞系形成泡沫细胞,显微镜下观察,oxLDL作用后细胞胞体变大,胞内红色颗粒物质增多。通过胆固醇含量测定发现随着oxLDL剂量的增加,泡沫细胞形成比例逐渐增加,oxLDL浓度达到80μg/ml时,与空白组相比,胞内TC、FC、CE水平显著升高(p<0.01),且CE/TC>50%。流式细胞仪测定线粒体膜电位发现oxLDL作用24h后细胞线粒体膜电位明显下降。经Hoechst33342染色观察细胞核形态,结果表明随着oxLDL浓度的增加,部分细胞核质浓缩呈致密浓染,表明细胞核受到氧化损伤。DNA ladder发现,oxLDL可使细胞核内DNA产生氧化断裂片段,产生500bp以下的DNA片段。上述结果表明：80μg/ml的oxLDL可诱导巨噬细胞形成泡沫细胞,同时oxLDL对泡沫细胞产生氧化损伤。2.水蛭酶解物对泡沫细胞的作用MTT结果显示300μg/ml以下水蛭酶解物对细胞的活力无影响。选取75μg/ml,150μg/ml和300μg/ml低中高浓度水蛭酶解物作用于泡沫细胞24h后,胆固醇含量测定结果显示胞内TC、FC和CE含量均显著性下降并呈现剂量依赖性,其中中、高剂量组CE/TC<50%效果明显。油红O染色发现胞内红色颗粒明显减少,表明水蛭酶解物能够降低泡沫细胞内的脂质含量,并对泡沫细胞的形成具有抑制作用。流式细胞仪测定线粒体膜电位结果表明膜电位的下降也受到一定程度的抑制；Hoechst33342染色发现细胞核质浓缩比例下降；DNA ladder图中DNA断裂片段减少。以上结果表明：水蛭酶解物对泡沫细胞的形成具有抑制作用,并具有抗oxLDL对泡沫细胞的氧化损伤作用。3.水蛭酶解物抑制泡沫细胞形成的机制MDC染色结果发现,水蛭酶解物作用于泡沫细胞后,细胞内荧光颗粒增多,用自噬抑制剂3-MA处理后,荧光颗粒减少；Western blot显示,水蛭酶解物处理后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值上升,用3-MA处理后比值有所下降；同时发现经3-MA处理后油红O染色颗粒增加,胆固醇含量升高。线粒体膜电位测定和DNA ladder结果显示,3-MA处理后抑制膜电位下降作用减弱,DNA断裂片段增加,以上结果表明：水蛭酶解物通过自噬过程抑制泡沫细胞的形成和抗oxLDL的氧化损伤作用。ACAT1、ABCA1和LXRa的PCR结果发现,水蛭酶解物不能影响ABCA1和LXRa转录水平的变化。但能上调ACAT1的转录水平,3-MA处理后这种上调作用受到抑制。以上结果表明：水蛭酶解物不能影响胆固醇的外排作用,但可以上调ACAT1的转录水平,此过程与自噬过程有关,进一步证实水蛭酶解物是依赖自噬机制发挥作用。综上所述,本实验研究结果表明,水蛭酶解物能够很好地降低泡沫细胞内脂质含量,使泡沫细胞形成受到抑制,并能保护细胞氧化损伤,同时发挥作用的机制是依赖于胞内自噬过程,通过调控自噬水平发挥作用,因此为以后水蛭用药提供了理论基础,为临床应用提供借鉴。