论文部分内容阅读
全球的癌症死亡率和发病率增长迅猛。目前，化疗和免疫是治疗各种恶性肿瘤的两种重要手段。化学疗法通过其直接的细胞毒性作用消除肿瘤，而免疫疗法中的细胞免疫则可以通过T细胞介导的免疫反应清除肿瘤。化学疗法能够去除原发性肿瘤，但通常无法有效解决肿瘤转移问题。然而，临床上癌症患者死亡的关键点在于肿瘤转移。最近，免疫疗法被证明是根除转移性肿瘤的有效方法。因此，化学疗法与免疫疗法相结合是治疗癌症的有效策略。
某些化疗药物在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，还能触发免疫反应。然而，由于肿瘤组织具有严重免疫抑制的性质，在化学治疗的同时引起的这种潜在的免疫反应通常非常弱。因此设计一种可以激发化学疗法免疫治疗潜力的极简纳米药物平台，用以通过自我联合化学免疫极大地提高总体治疗效果，具有重要意义。
髓源抑制细胞(MDSCs)和吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是引起免疫逃逸并导致肿瘤进展和转移的主要因素。MDSCs大量聚集在脾脏和肿瘤部位，可以通过多种机制抑制T细胞功能。IDO可以将色氨酸(Trp)降解为犬尿酸(Kyn)，从而导致T细胞无能，并使幼稚的CD4+T细胞分化为调节性T细胞(Tregs)。IDO在肿瘤细胞和MDSCs中均过表达。因此，开发设计一种能够有效逆转由MDSCs和IDO诱导的免疫逃逸的药物纳米平台，对于成功唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力至关重要。
近年来，无载体纳米药物递送系统以其独特的优点而备受关注，例如高药物荷载量、高药物稳定性、肿瘤蓄积行为的改善、无载体诱导的毒副作用等。然而，很少有基于肿瘤微环境多重调节的无载体纳米药物递送系统用于免疫治疗。因此，本课题提出了一种自递送的双前药纳米平台策略，构建化疗药吉西他滨(GEM)以及IDO抑制剂1-甲基-色氨酸(1MT)两亲性双前药(GEM-1MT)，通过清除MDSCs和抑制IDO作用，实现唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力，并检测了所构建的纳米平台的体内、外抑瘤效果及免疫效应:
首先通过化学合成法，使用常用羟基、氨基保护基—(BOC)2O来保护GEM的3-羟基和4-氨基，用(BOC)2O保护1MT的氨基，随后将保护后的GEM上的剩余羟基和保护后的1MT上的剩余羧基进行酯化反应，最后脱保护基得到目标化合物GEM-1MT。1H-NMR验证特征峰以及质谱验证分子离子峰，表明GEM-1MT合成成功。纳米沉淀法制备GEM-1MT纳米粒(GEM-1MT NPs)并对其进行体外基础表征，透射电子显微镜(TEM)图片显示GEM-1MTNPs为均匀类球形，动态光散射(DLS)测定纳米粒粒径为104.73±0.57nm(PDI=0.168±0.005)，满足高渗透长滞留效应(EPR)要求。溶血实验结果显示GEM-1MTNPs溶血率小于4％，表明较好的生物相容性，符合静脉注射要求。分别在pH=5.0和7.4以及pH=5.0+酶的PBS释放介质中验证制剂的体外释放性能，结果表明制剂在溶酶体酸性及酶环境下能够有效释放药物。
在B16F10细胞中评价制剂的细胞摄取情况，激光共聚焦图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对GEM-1MTNPs具有较高的摄取行为。且低温(4℃)和能量抑制(用NaN3预处理细胞)条件下实验结果表明GEM-1MTNPs通过内吞的方式进入细胞。采用MTT法研究制剂对肿瘤细胞的体外细胞毒性，实验结果显示，与原料药相比，GEM-1MTNPs可以导致更高的肿瘤细胞生长抑制率。考察了GEM-1MTNPs或1MT培养后B16F10或MDSCs培养基中Kyn的含量，结果表明1MT和GEM-1MTNPs对Kyn的产生有很强的抑制作用，显示出高效的IDO抑制作用。通过细胞凋亡实验检测制剂对MDSCs的抑制作用，结果表明GEM-1MTNPs能有效消除MDSCs。通过荧光拍照实验检测钙网蛋白(CRT)的胞膜外翻情况，结果表明，GEM-1MTNPs可以有效地引起肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)。考察了树突状细胞(DCs)表面CDS0和CD86的变化，验证了GEM-1MTNPs处理后的肿瘤细胞残渣对DCs成熟的刺激作用，结果证明了GEM-1MTNPs可以有效地激活抗肿瘤免疫反应。
通过小鼠黑色素瘤模型，验证药物的体内分布、体内药效和系统毒性。小动物活体成像结果表明制剂能在肿瘤部位有效蓄积。体内抗肿瘤实验中，GEM-1MTNPs具有较强的抑制肿瘤的生长和抑制肺转移的能力。H&E染色结果表明制剂对各主要器官无明显影响，表明较好的生物相容性。采用流式细胞术和免疫荧光染色法阐明制剂在增强抗肿瘤免疫治疗中的作用和机制，结果表明GEM-1MTNPs能高效上调肿瘤组织以及脾内CD4+T细胞、CD8+T细胞的数量，并且减少免疫抑制性Tregs、MDSCs的比例，从而增强抗肿瘤免疫治疗活性。此外还考察了小鼠长期免疫记忆效应，结果显示制剂能有效引起免疫记忆的产生。
综上，本课题提出了一种自递送的双前药纳米药物策略，该策略可以唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力，通过消除MDSCs和抑制IDO，增强化学免疫联合疗法的整体治疗效果。本研究为设计先进的极简化学免疫联合疗法纳米平台提供了新思路。
某些化疗药物在诱导肿瘤细胞发生凋亡的同时，还能触发免疫反应。然而，由于肿瘤组织具有严重免疫抑制的性质，在化学治疗的同时引起的这种潜在的免疫反应通常非常弱。因此设计一种可以激发化学疗法免疫治疗潜力的极简纳米药物平台，用以通过自我联合化学免疫极大地提高总体治疗效果，具有重要意义。
髓源抑制细胞(MDSCs)和吲哚胺2，3-双加氧酶(IDO)是引起免疫逃逸并导致肿瘤进展和转移的主要因素。MDSCs大量聚集在脾脏和肿瘤部位，可以通过多种机制抑制T细胞功能。IDO可以将色氨酸(Trp)降解为犬尿酸(Kyn)，从而导致T细胞无能，并使幼稚的CD4+T细胞分化为调节性T细胞(Tregs)。IDO在肿瘤细胞和MDSCs中均过表达。因此，开发设计一种能够有效逆转由MDSCs和IDO诱导的免疫逃逸的药物纳米平台，对于成功唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力至关重要。
近年来，无载体纳米药物递送系统以其独特的优点而备受关注，例如高药物荷载量、高药物稳定性、肿瘤蓄积行为的改善、无载体诱导的毒副作用等。然而，很少有基于肿瘤微环境多重调节的无载体纳米药物递送系统用于免疫治疗。因此，本课题提出了一种自递送的双前药纳米平台策略，构建化疗药吉西他滨(GEM)以及IDO抑制剂1-甲基-色氨酸(1MT)两亲性双前药(GEM-1MT)，通过清除MDSCs和抑制IDO作用，实现唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力，并检测了所构建的纳米平台的体内、外抑瘤效果及免疫效应:
首先通过化学合成法，使用常用羟基、氨基保护基—(BOC)2O来保护GEM的3-羟基和4-氨基，用(BOC)2O保护1MT的氨基，随后将保护后的GEM上的剩余羟基和保护后的1MT上的剩余羧基进行酯化反应，最后脱保护基得到目标化合物GEM-1MT。1H-NMR验证特征峰以及质谱验证分子离子峰，表明GEM-1MT合成成功。纳米沉淀法制备GEM-1MT纳米粒(GEM-1MT NPs)并对其进行体外基础表征，透射电子显微镜(TEM)图片显示GEM-1MTNPs为均匀类球形，动态光散射(DLS)测定纳米粒粒径为104.73±0.57nm(PDI=0.168±0.005)，满足高渗透长滞留效应(EPR)要求。溶血实验结果显示GEM-1MTNPs溶血率小于4％，表明较好的生物相容性，符合静脉注射要求。分别在pH=5.0和7.4以及pH=5.0+酶的PBS释放介质中验证制剂的体外释放性能，结果表明制剂在溶酶体酸性及酶环境下能够有效释放药物。
在B16F10细胞中评价制剂的细胞摄取情况，激光共聚焦图片和流式细胞术结果共同说明了细胞对GEM-1MTNPs具有较高的摄取行为。且低温(4℃)和能量抑制(用NaN3预处理细胞)条件下实验结果表明GEM-1MTNPs通过内吞的方式进入细胞。采用MTT法研究制剂对肿瘤细胞的体外细胞毒性，实验结果显示，与原料药相比，GEM-1MTNPs可以导致更高的肿瘤细胞生长抑制率。考察了GEM-1MTNPs或1MT培养后B16F10或MDSCs培养基中Kyn的含量，结果表明1MT和GEM-1MTNPs对Kyn的产生有很强的抑制作用，显示出高效的IDO抑制作用。通过细胞凋亡实验检测制剂对MDSCs的抑制作用，结果表明GEM-1MTNPs能有效消除MDSCs。通过荧光拍照实验检测钙网蛋白(CRT)的胞膜外翻情况，结果表明，GEM-1MTNPs可以有效地引起肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(ICD)。考察了树突状细胞(DCs)表面CDS0和CD86的变化，验证了GEM-1MTNPs处理后的肿瘤细胞残渣对DCs成熟的刺激作用，结果证明了GEM-1MTNPs可以有效地激活抗肿瘤免疫反应。
通过小鼠黑色素瘤模型，验证药物的体内分布、体内药效和系统毒性。小动物活体成像结果表明制剂能在肿瘤部位有效蓄积。体内抗肿瘤实验中，GEM-1MTNPs具有较强的抑制肿瘤的生长和抑制肺转移的能力。H&E染色结果表明制剂对各主要器官无明显影响，表明较好的生物相容性。采用流式细胞术和免疫荧光染色法阐明制剂在增强抗肿瘤免疫治疗中的作用和机制，结果表明GEM-1MTNPs能高效上调肿瘤组织以及脾内CD4+T细胞、CD8+T细胞的数量，并且减少免疫抑制性Tregs、MDSCs的比例，从而增强抗肿瘤免疫治疗活性。此外还考察了小鼠长期免疫记忆效应，结果显示制剂能有效引起免疫记忆的产生。
综上，本课题提出了一种自递送的双前药纳米药物策略，该策略可以唤醒化学疗法潜在的免疫治疗能力，通过消除MDSCs和抑制IDO，增强化学免疫联合疗法的整体治疗效果。本研究为设计先进的极简化学免疫联合疗法纳米平台提供了新思路。