流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae，HI)主要寄生于人体上呼吸道，属条件致病菌，在机体抵抗力降低或局部微生态平衡失调时，入侵机体引起感染，HI感染以中老年人伴有严重基础疾病的偏多，近年来国内外研究表明，流感嗜血杆菌在呼吸道感染的疾病中占有非常重要的地位，严重威胁着人类的健康及生命。由该菌引起感染发病率一直难以估计，且流感嗜血杆菌的感染发病呈上升趋势，耐药率，耐药范围有所增加。给临床治疗带来极大的困难，病死率高。因此在全球范围内引起医学界的高度重视。慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)已经成为人类死亡原因的第四位，致死的主要原因是由于呼吸道继发感染导致呼吸衰竭，而导致COPD呼吸道感染的病原体中，百分之四十到百分之五十为细菌，且以流感嗜血杆菌最为多见。若要减少和控制COPD患者继发流感嗜血杆菌感染的发病率和死亡率就要对流感嗜血杆菌的感染做出早期快速准确的诊断、采用合理有效的药物进行及时治疗、并迅速掌控菌株流行动态、及早预防是非常必要的。随机引物扩增DNA多态性分析技术(Random Amplified Polymorphic DNAAnalysis)——RAPD是一种新的揭示基因组多态性的快速分型方法。该法所需标本量极少，技术操作简便，特异性强，分型及分辨力强。其在临床中主要用以鉴别二菌株是否同源，即菌株间的相互关系，以发现疾病可能的潜在传染源，治疗失败或反复感染的原因，以及致病菌在人与人之间的可能传播途径。因为不同地区分离的HI菌株对同一种抗生素的敏感程度不同。因此必须参照本地区的流感嗜血杆菌的药敏检测结果进行用药，应避免经验性盲目用药，减少抗生素选择压力降低耐药菌株的产生。因此这项研究对了解本地区慢性阻塞性肺病继发感染流感嗜血杆菌的现状、菌株特性、流行趋势、耐药特征、从而为临床提供合理可靠的用要依据，及时控制病原、降低病死率具有十分重要的意义。目的：本研究对张家口地区慢性阻塞性肺病继发感染流感嗜血杆菌的感染现状、耐药情况、流行菌株基因分布特点进行分析，以便有效指导临床合理用药及时控制病情发展。同时采用RAPD技术调查分离的眦菌株在本地区的流行特征，同时对RAPD的反应体系进行优化，以期建立稳定的临床分型条件体系。 方法：(1)流感嗜血杆菌分离鉴定：规范采集慢性阻塞性肺病患者痰标本并尽快接种于自制的巧克力色平板培养基上，进行流感嗜血杆菌的常规培养，严格按照《全国临床检验操作规程》进行鉴定。(2)细菌DNA制备：将收集的湿菌体悬于SE (Somatic Embryo，SE)液中，加入裂解物SDS，60℃水浴10min：加入饱和酚、氯仿-异戊醇，充分振荡脱蛋白质5min：8000r/min离心10min：吸出上层水相，加2倍体积的冰冷无水乙醇，用玻璃棒搅出丝状沉淀的DNA。等玻璃棒上的乙醇挥发干，将其溶于TE缓冲液中置4℃备用。(3)PCR反应体系组成与扩增条件：反应总体积为25μl，4种dNTPs各200μmol/L，TaqDNA聚合酶2.5U，MgCl<,2>浓度2.0mmol/L，引物浓度0.5μmol/L，模板浓度0.05ng/μl。将反应成分混合物置于PCR扩增仪中， 94℃4min，(94℃40s，30℃40s，65℃2min)×35循环，72℃5min。(引物、镁离子、模板浓度、温度及循环参数值的确定采用单因素设计)(4)取扩增产物10μl，于15g/L琼脂糖凝胶电泳，恒压80V，2小时。(5)紫外透射仪下观测结果并摄影。(6)用微量液体稀释法测十种抗生素对36株流感嗜血杆菌的最低抑菌浓度。 结果：(1)本试验规范采集慢性阻塞性肺病患者的清晨深咳痰，标本共152例，分离出36株流感嗜血杆菌，分离率为23.68％，其中男22例、女14例，年龄53岁至81岁。一附院呼吸科病人21株，“251”医院呼吸科病人10株，建国医院呼吸科病人5株。(2)36株流感嗜血杆菌对10种抗生素的耐药性呈现不同的结果，其中四环素耐药率为77.78％：SMZ/TMP耐药率为63.89％；氨苄青霉素耐药率为47.22％；阿奇霉素耐药率为33.33％；氯霉素耐药率为22.22％；环丙沙星耐药率为19.44％；头孢克罗耐药率为5.56％；阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢呋辛耐药率为0％。实验表明近年来张家口地区慢性阻塞性肺病患者继发感染流感嗜血杆菌耐药性高且耐药范围广，阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢呋辛是本地区目前治疗该菌的首选药物。供临床医师参考选择。(3)RAPD分型共有6种不同基因型。其中基因A型一条带、分子量为600KD、共2株，占5.56％；基因B型三条带、分子量为600KD、500KD、400KD、共20株，占55.55％；基因C型四条带、分子量600KD、500KD、400KD、300KD共4株，占11.11％；基因D型五条带、分子量600KD、500KD、400KD、300KD、200KD共2株，占5.56％；基因E型五条带、分子量600KD、500KD、400KD、250KD、200KD共2株，占5.56％；基因F型四条带、分子量600KD、500KD、400KD、200KD共6株，占16.66％。表明基因B型为优势菌株，是近年来张家口地区呼吸道感染的主要相关菌株。(5)RAPD反应体系优化结果：引物浓度为0.5μmol/L时扩增效果最好；DNA模板浓度在0.50ng/μl、2ng/μl均得到了良好的扩增效果；镁离子浓度在2.0m mol/L、4.0 m mol/L时扩增效果较好；退火温度：在3Q℃时扩增条带最清晰；循环参数：35、45个循环时扩增效果均好。 结论：(1)基因B型的流感嗜血杆菌是近年来张家口地区慢性阻塞性肺病呼吸道继发感染的主要型别。其它均为散发。(2)本地区流感嗜血杆菌对常用抗生素的耐药率较高且耐药范围较广。(3)阿莫西林/克拉维酸、头孢曲松、头孢呋辛都具有较高的抗HI活性，是本地区目前治疗该菌引起呼吸道感染的首选药物。(4)RAPD分型的灵敏度、特异性及可靠性优于其他分型方法，在流行病学调查中具有较大的应用价值。(5)本试验对RAPD反应条件进行优化，获得了较稳定的检测条件体系。(6)对难治的慢性阻塞性肺病继发感染的病人，迅速对其进行RAPD检测分型，并采取隔离措施，根据药敏结果进行用药，对提高临床治愈率具有重要意义。