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人肝细胞具有重要的临床和科研应用价值,但体外大量扩增人肝细胞却很困难,于是大量的科研者寻求肝内和肝外干细胞或祖细胞,试图将它们诱导成肝细胞或者肝细胞样的细胞以取代原代肝细胞应用于临床或科研。成年动物干细胞含量很少,且体外大量扩增并保持未分化状态的问题没有很好解决,无法满足临床的应用,因此很多学者将研究方向转向胚胎组织。他们认为胚胎样品中干细胞含量多,分离,纯化易于进行,且其增殖能力较成体干细胞强,甚至可以无限增殖,免疫原性弱,因此胚胎作为干细胞的来源深受重视。迄今为止,已有一些文献报道了胎儿不同组织中都存在肝干细胞,且类型多样。
目的:①探讨人胎儿肺脏间充质干细胞能否向肝细胞分化;②以胎肝中C-kit+细胞作为研究对象,分析这种细胞作为肝干细胞的特征。
方法:①用酶消化法和机械分离法获得胎儿肺脏细胞,所得细胞经基本培养基(DMEM/F12+10%FBS)培养,取第四代的细胞使用流式细胞术和RT-PCR技术进行间充质干细胞表面标志的检测和所分泌的细胞因子的检测,再结合形态观察,从三方面鉴定我们从胎儿肺脏中成功地培养了间充质干细胞。为了进一步了解肺脏间充质干细胞在不同培养条件下的增殖情况,我们另选了一种小牛血清,设计了四种不同条件:①DMEM/F12+10%FBS;②DMEM/F12+5%FBS;⑨DMEM/F12+10%NCS;④DMEM/F12+5%NCS。我们的结果表明肺脏MSC生长状态均良好。由于FBS远远贵于NCS,所以在以后培养MSC可以考虑使用NCS替代FBS。为了探讨肺脏MSC能否分化成肝细胞,设计了诱导组(培养条件:DMEM/F12+10%FBS4-20ng/mlHGF+40ng/mlEGF+20ng/mlbFGF)和对照组(培养条件DMEM/F12+10%FBS),同时培养18天,每隔三天观察细胞形态的变化,用流式细胞仪分析胞浆内Alb,AFP和CK19的表达,同时用RT-PCR检测IL-6、M-CSF、Alb、AFP和CK19的mRNA的表达,并且在第18天检测了细胞表面标志CD29、CD34、CD44和CD45的表达。②选用密度为1.077g/ml的淋巴细胞分离液和密度为1.070g/ml的percoll分离液分离胎肝细胞,流式细胞仪检测界层细胞C-kit+的得率;混合培养,探讨C-kit+细胞的生长特征和形态特征;HGF和EGF诱导C-kit+细胞分化。
结果:①肺脏MSC形态上由成纤维样转变成多角形、上皮样、类似于肝细胞;较弱地表达Alb和AFP的mRNA和蛋白。②淋巴细胞分离液和percoll分离液均能提高C-kit+细胞的得率,但得到的细胞绝对数量依然有限;C-kit+细胞主要形成集落生长,少量可悬浮生长,细胞形态表现为小、圆、胞浆稀少;HGF和EGF诱导培养9天,C-kit+细胞可分化成CK19+的胆管细胞。
结论:①形态变化和肝细胞特异性蛋白和基因的表达暗示了胎儿肺脏MSC可转分化成肝细胞样的细胞。②胎肝中的C-kit+细胞含量很少,体外具有增殖和分化潜能,广义上来说符合肝干细胞的定义范畴。