[目的]在急性或慢性肝衰竭中,肝细胞移植被推荐作为一种改善肝功能的辅助方法,并作为“细胞疗法”用于肝脏代谢性疾病的治疗。诱导胚胎干细胞分化成肝细胞,行肝细胞移植治疗肝脏疾病,有着诱人的前景。本研究,通过构建小鼠慢性肝衰竭模型,体外实验成功诱导人胚胎干细胞分化为肝细胞,然后对慢性肝衰竭小鼠进行肝细胞移植。观察肝细胞移植对慢性肝衰竭小鼠的影响,为慢性肝衰竭提供一种新的治疗思路。[方法]1.小鼠慢性肝衰竭模型的构建：采用腹腔注射50%四氯化碳植物油溶液诱发小鼠慢性肝衰竭。观察造模后相应时相点各组小鼠的一般情况、肝功能生化指标及小鼠组织病理学改变。2.体外实验诱导胚胎干细胞向肝细胞分化：将人胚胎干细胞株BG0BG02细胞集落接种到预先包被有Matrigel的培养板上贴壁4d后,加入含有激活素A(ActivinA)的基础分化液诱导5d；然后将诱导液换为肝分化液诱导6d；在肝分化液中添加HGF和OSM继续诱导分化5～7d。分别于不同诱导阶段,采用RT-PCR和Western blot法检测hESC不同诱导阶段肝细胞标志物甲胎球蛋白(AFP)、白蛋白(ALB)的表达,倒置相差显微镜观察hESC诱导分化后细胞的形态学变化。3.肝细胞移植对小鼠慢性肝衰竭的治疗作用：用成功分化的肝细胞移植入慢性肝衰竭的小鼠,从小鼠尾静脉直接穿刺后移植约6.0×106细胞；分别在相应处理后第1天,7天及15天,采用全自动生化仪直接检测小鼠肝功能指标丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、白蛋白(ALB)；同时留取相应时相点动物肝脏组织,置液氮保存或直接进行冰冻切片作病理学观察。[结果]1.肝衰竭模型肝脏病理学变化及肝脏生化指标变化①正常组小鼠肝脏正常,呈鲜红色,表面光滑、边缘锐利；病理切片示肝小叶形态结构正常,汇管区形态完整,未见变性和坏死。模型组肝脏体积明显缩小,颜色黯淡,边缘钝,质硬,表面有大量纤维渗出物,与周围组织粘连；病理切片显示肝细胞出现典型的胞浆疏松化、气球样变,可见散在的点状、碎片状坏死及炎性细胞浸润；还伴有明显的纤维化改变。②模型组的血清ALT和AST水平均明显升高,显著高于正常组。2. hESC诱导分化后细胞的形态学变化及RT-PCR、Western blotting检测AFP、 ALB的表达情况①经细胞活化素A、FGF-1、骨形态发生蛋白4(BMP-4)、OSM连续诱导10天后细胞形态学改变,细胞变大,呈椭圆形或多边形。诱导15后,一些细胞有2个或3个核,呈现肝细胞特有的形态。②hESC诱导分化后细胞表达肝细胞特异性蛋白ALB、ALP,并随诱导时间的延长表达量逐渐增加。3.人胚胎干细胞移植后肝组织学改变正常组肝组织切片HE染色,显示肝小叶结构清晰,肝小叶以中央静脉为中轴,肝细胞索呈放射状排列,肝血窦清晰。模型组：7d,肝小叶结构部分破坏,肝细胞大量溶解,有炎性细胞浸润,窦状隙堵塞,内皮细胞损坏,肝细胞核浆边缘不清,肝细胞内出现大量空泡；15d,有大量炎性细胞浸润,肝细胞仍可见空泡化结构。治疗组：1d,肝小叶结构以中央静脉为中心呈区域性溶解,肝细胞部分溶解,有少量炎性细胞浸润；7d,肝细胞双核增多,并出现炎性细胞浸润；15d,肝细胞以变性和炎性细胞浸润为主,坏死灶小、充血以及出血现象减轻。4.人胚胎干细胞移植后肝脏生化指标变化在肝细胞移植后第1d,治疗组与模型组无显著性差异(P>0.05),但治疗组与模型组肝功能指标(ALT、AST、ALP)均显著高于正常组(P<0.05),在第7d时相点,模型组与治疗组除了ALB无显著改变外,其余指标均有显著差异(P<0.05)。在第15d,除ALP、ALB外,ALT、AST存在差异(P<0.05),同时,治疗组与正常组比较中,治疗组小鼠AST基本趋于正常范围,其余指标有所改善,但仍未恢复。[结论]1.应用每隔三天一次,连续7周腹腔注射50%四氯化碳溶液1ml/kg体重可诱导小鼠的慢性肝衰竭模型,病变稳定,操作简单,可供实验研究应用。2.在特定的在体外培养条件下,肝细胞生长因子(HGF)等细胞因子能诱导人胚胎干细胞BG02向肝细胞分化,并表达表达肝细胞特异性蛋白ALB及AFP。3.经小鼠鼠尾静脉的肝细胞移植能明显改善慢性肝衰竭小鼠的肝功能,促进肝功能恢复,改善小鼠肝脏病理状况。