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bHLH（basic Helix-Loop-Helix）转录因子是植物第二大转录因子家族,参与植物生长发育和激素调节等多个调控过程,其N-端含DNA识别与结合位点,约50%的bHLH转录因子N-端basic区含高度保守的H5-E9-R13序列,此为结合DNA不可缺少的结构;bHLH转录因子的C-端为螺旋-环-螺旋区域,约含40多个氨基酸。bHLH转录因子普遍被认为以二聚体的形式发挥功能。花生（Arachis hypogaea）是重要的经济作物和油料作物,种子休眠和萌发是其生命周期中两个重要阶段。种子休眠是植物对环境适应性的一种特性,休眠的种子遇到有利环境时,即开始萌发。一些花生种子具有生理休眠特性,如若不采用催芽等技术手段,种子萌发速度过慢,有些甚至难以萌发,进而影响产量、食用安全及种植效益,因此对花生种子萌发性研究十分必要。本课题组前期根据转录组测序数据,筛选得到了1个萌发前后关键期表达水平显著差异的基因。由于在刚刚萌发的花生种子中表达水平较高,因此,暂时将其命名为AhHEGS1（High Expression in just-Germinated Seeds 1）。实验中发现AhHEGS1基因存在可变剪切现象。本研究将明确AhHEGS1基因剪接异构体表达模式的差异;采用酵母转录激活及亚细胞定位法进行转录因子特性分析,确定转录激活区;构建表达载体,转化至花生及拟南芥（Arabidopsis thaliana）中对AhHEGS1进行功能鉴定。为深入理解花生萌发过程调控的分子机理奠定基础。通过上述研究,主要结果如下:（1）AhHEGS1基因序列分析。测序发现剪接体AhHEGS1.1和AhHEGS1.2基因的c DNA分别为1,219 bp和1,237 bp,其ORF分别为1,188 bp和1,152 bp,分别由395个氨基酸和383个氨基酸组成各自的编码蛋白;AhHEGS1.2蛋白与AhHEGS1.1相比C端少12个氨基酸。两剪接体的区别在于转录后剪切掉了两种大小不一的第6内含子,AhHEGS1.1选择性地剪切掉了较大的第6内含子（358bp）;而AhHEGS1.2剪切掉较小的内含子。比对AhHEGS1氨基酸序列与其他物种相关氨基酸序列,结果显示花生AhHEGS1蛋白与大豆（Glycine max）Gm CIB1、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）MtbHLH63、密花豆（Spatholobus suberectus）SsbHLH63等序列的相似性都超过了55%;与已知功能的拟南芥At CIB1亲缘关系相对较远。（2）AhHEGS1时空表达模式分析。利用荧光实时定量PCR（q RT-PCR）分析丰花1号（FH1）花生不同组织的表达模式。结果显示,AhHEGS1两剪接体均在花中表达量最高,根中表达量较低,AhHEGS1.1整体表达高于AhHEGS1.2;取果针入土10～70 d的去种皮种子为样品进行表达分析,发现果针入土30～50d该基因的表达量最高;AhHEGS1.1和AhHEGS1.2两剪接体表达水平在整个发育过程中呈现“你追我赶”趋势。两剪接体对水吸胀不同时间的种子响应较为一致,表现为吸胀后种子表达升高,整个种子萌发过程AhHEGS1.1基因表达水平高于AhHEGS1.2,此结果表明AhHEGS1基因可能在花生种子的萌发过程发挥作用。（3）AhHEGS1激素响应模式分析。AhHEGS1启动子调控元件分析发现启动子区包含很多激素响应元件。实验室前期利用外源脱落酸（ABA）处理萌发种子,发现AhHEGS1基因表达不受外源ABA调控。为进一步确定AhHEGS1是否参与激素的信号通路调控过程,本实验利用q RT-PCR分析了两剪接体对不同浓度ABA抑制剂氟啶酮（fluridone,FL）、赤霉素（GA3）及其抑制剂多效唑（PAC）等单独或组合处理的应答反应,发现:AhHEGS1.1和AhHEGS1.2表达均受GA3诱导,其中AhHEGS1.1剪接体对GA3的敏感性高于AhHEGS1.2;萌发前期较高水平的内源ABA诱导AhHEGS1.1表达增强,而对AhHEGS1.2影响不大。总之,GA和ABA在种子萌发过程中对AhHEGS1基因表达具有重要的调控作用。基因对生长素（IAA）和2,4-表油菜素内酯（BR）及其抑制剂的响应实验正在进行。（4）AhHEGS1启动子的功能验证。在17号染色体克隆得AhHEGS1的启动子片段大小为2,124 bp,在7号染色体的相对序列克隆得到1,971 bp。构建了AhHEGS1基因启动子驱动GUS表达的植物表达载体AhHEGS1-p17-p CAMBIA3301和AhHEGS1-p07-p CAMBIA3301,并转化拟南芥,目前正在进行转化植株的筛选。（5）AhHEGS1的转录因子特性分析。亚细胞定位发现,AhHEGS1两融合蛋白均定位于细胞核。酵母激活分析实验显示,AhHEGS1两蛋白均具备转录激活的特性,转录激活结构域位于蛋白的C-端。（6）AhHEGS1花生转基因功能鉴定。此前课题组构建了植物过表达载体p ROKII-AhHEGS1,并转化花生。本研究经PCR验证及测序分析,获得了来自6个转化事件的T2代过表达花生株系,其中4个转化事件的后代是纯合株系。种子萌发表型分析还发现,T4代过表达花生萌发速率比FH1更快。本研究还构建了AhHEGS1的CRISPR/Cas9敲除载体p CAMBIA1300-cas9-AhHEGS1载体,并转化花生,正在进行转化花生的筛选工作。本研究目前取得的结果还比较初步,AhHEGS1启动子功能的实验正在进行,接下来我们会观察转基因拟南芥不同萌发和不同激素处理时间GUS的表达情况。另外,筛选得到转CRISPR/Cas9敲除载体的植株后,初步计划结合激素响应的结果观察种子的萌发情况,此外我们将结合激素响应与基因功能分析情况,通过转录组的手段结合Ch IP-Seq等分子生物学手段分析该基因的调控网络,深入了解AhHEGS1在种子萌发过程的作用。