【摘 要】
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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原,流行区域广泛,可感染多种鱼类,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括
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鳗弧菌(Vibrio anguillarum)是一种对水产鱼类危害严重的细菌病原,流行区域广泛,可感染多种鱼类,常给水产养殖业造成巨大的经济损失。鳗弧菌的致病性与许多毒力因子有关,包括胞外蛋白酶、由质粒编码的铁吸收系统、细胞外溶血毒素、细菌鞭毛蛋白等。研究发现胞外蛋白酶是重要的致病因子之一,参与了细菌入侵宿主的毒力机制。鳗弧菌金属蛋白酶全基因ORF编码611个氨基酸的前体前蛋白,包含有四个结构域:信号肽、N-末端的前体肽、成熟区(蛋白酶区)和C-末端延伸区;在随后的分泌过程中切除信号肽和前体肽形成成熟蛋白,分泌到细胞外的成熟蛋白分子量是36kDa,具有活性的蛋白分子量是45 kDa或者47 kDa。为了更好地研究EmpA的表达与加工,本研究将empA基因克隆到阿拉伯糖诱导表达载体pBAD24上,构建重组表达载体pBAD-VAP,在大肠杆菌TOP10中通过加入阿拉伯糖诱导EmpA表达,重组蛋白通过SDS-PAGE和Immunoblotting鉴定分子量为36kDa,与从鳗弧菌细胞培养基上清中纯化的蛋白分子量完全相同,分子量为36kDa的重组蛋白N-端6个氨基酸序列同Milton等报导的成熟EmpA以及前体蛋白全长序列中从200到205氨基酸序列一致,也与根据全长序列推测的44.6kDa蛋白的N-端序列一致,说明重组蛋白的C-端存在大约9 kDa多肽的加工,并发现加热促进蛋白的C-端9kDa多肽的加工,使44.6kDa的蛋白加工成36kDa的成熟蛋白。将重组表达载体pBAD-VAP转入大肠杆菌MC4100A(wt)、CU164A(SecY缺陷型)和B1LKOA(tat缺陷型)中,通过诱导表达EmpA,研究蛋白的转运与加工过程。研究发现,EmpA在大肠杆菌中通过sec途径转运,转运到细胞周质中,在细胞周质中的活性蛋白是相同的分子量(44.6 kDa)构象不同的两种蛋白。有趣的是,在细胞的原生质中,聚集的蛋白前体能够转变成有活性的蛋白酶。当样品加热时,44.6 kDa的EmpA C-端进一步加工,这种加工过程不同于鳗弧菌相同的蛋白和一些同源的锌-蛋白酶。研究发现,蛋白的加工
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