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目的:矽肺是我国最主要的职业病之一,容易在长期接触游离二氧化硅粉尘的职业性人群中发生。进入肺泡的游离二氧化硅粉尘能够被巨噬细胞吞噬但无法被分解,从而造成了肺部持续的炎症损伤和过度的纤维化修复。目前尚无治愈矽肺的疗法,因此需要寻找新的有效药物来延缓矽肺炎症和纤维化的发生发展。冬凌草甲素是传统中药冬凌草的活性提取成分,具有广泛的抗炎和免疫调节作用,已被报道在急性肺损伤、炎症性肠病、骨关节炎、胰腺炎和神经炎中都能发挥作用。本研究旨在探究冬凌草甲素对矽肺的影响,揭示其可能作用机制及分子靶标,以期为矽肺的预防和治疗提供新的依据。研究方法:首先,在体内考察冬凌草甲素对矽肺小鼠的影响。采用一次性气管滴注二氧化硅悬液的方式构建矽肺模型,通过皮下埋植的渗透压泵连续给予冬凌草甲素。给药7天后,采用吉姆萨染色法和细胞分类计数仪检测小鼠肺泡灌洗液（Bronchial alveolar lavage fluid,BALF）中的浸润细胞;采用H＆E和TUNEL染色法观察小鼠肺部的病理损伤;采用Real-time PCR和Luminex技术检测肺组织和BALF中的炎性因子水平。给药6周后,采用无创气道检测仪评价小鼠的呼吸功能;采用Masson和天狼星红染色法观察小鼠肺部的纤维化病变;采用肺系数和羟脯氨酸含量测定,考察小鼠的肺部肿胀和胶原增生情况。采用血细胞分析仪和血生化分析仪检测小鼠的骨髓功能、肝功能和肾功能;监测小鼠的每周体重变化。然后,在体外考察冬凌草甲素的作用机制。采用Label-free定量蛋白质组学研究,检测冬凌草甲素在肺内调控的生物学进程;在MH-S肺泡巨噬细胞系中,采用光学镜检、CCK-8法和CTL化学发光法,考察矽尘和冬凌草甲素的作用浓度和时间;采用CCK-F荧光法和透射电子显微镜检测MH-S细胞的活力和形态变化。采用Real-time PCR检测MH-S细胞M1型标志物Tnfa、Nos2及炎性标志物Ccl2;采用Luminex检测细胞培养上清液中IL6、CCL5和CCL11等炎性因子。采用Pull-down法检测MH-S细胞中与生物素化冬凌草甲素相互作用的蛋白;采用重组纯化技术制备靶蛋白iNOS,与冬凌草甲素共孵育后进行SDS-PAGE检测;采用BLI技术测定冬凌草甲素与iNOS之间的结合力;采用高分辨LC-MS/MS检测冬凌草甲素在iNOS上的修饰位点,再制备该位点的突变体进行验证;采用Docking技术模拟冬凌草甲素与iNOS的空间结合模式;通过Uniprot和BLAST数据库比对不同种属和不同亚型的NOS中,冬凌草甲素结合位点的保守性。最后,在生物水平上考察冬凌草甲素对iNOS的影响。采用Western blot检测MH-S细胞中iNOS的表达;采用活细胞探针DAF-FM检测iNOS产物NO的水平;采用Griess法检测iNOS产物氮氧化物的含量。在iNOS过表达MH-S细胞系中,采用免疫荧光法、Western blot和Real-time PCR检测冬凌草甲素对iNOS的影响。采用免疫组化法检测矽肺小鼠肺内iNOS的表达;采用比色法检测矽肺小鼠肺内iNOS的酶活力;采用Western blot检测iNOS上下游通路。通过纯化腺病毒过表达小鼠肺部iNOS后,采用免疫荧光法、Western blot和Real-time PCR检测冬凌草甲素对iNOS的影响。结果:1、冬凌草甲素延缓矽肺小鼠肺炎的发生发展。冬凌草甲素给药7天后,与模型组相比,给药组小鼠BALF中浸润的单核巨噬细胞和中性粒细胞的数量减少（p＜0.05）。BALF中的TNF-α、MCP-1、CCL11、G-CSF等炎性细胞因子、趋化因子和集落刺激因子在给药后含量降低（p＜0.05）。肺病理切片显示冬凌草甲素减轻了矽尘所致的肺泡结构损伤。肺组织中的Il18、Il23、Ccl3、Mip2、Gmcsf等炎性基因在给药后受到抑制（p＜0.05）。2、冬凌草甲素延缓矽肺小鼠肺纤维化的发生发展。冬凌草甲素给药6周后,模型组小鼠出现的潮气量降低和中位呼气流速升高等症状,在给药后得到了相应缓解（p＜0.05）。与空白组相比,模型组小鼠的肺门淋巴结肿大,肺系数升高,肺切片出现典型的矽结节,而冬凌草甲素减轻了上述病理改变（p＜0.05）。Masson和天狼星红染色显示,与模型组相比,给药组的肺纤维化程度降低。羟脯氨酸含量的测定也表明,冬凌草甲素抑制了矽尘所致的小鼠肺部胶原沉积（p＜0.05）。3、冬凌草甲素对矽肺小鼠无明显的毒性作用。冬凌草甲素给药6周后,检测小鼠外周血的生化指标。与空白组相比,给药组的网织红细胞、血小板、血红蛋白、丙氨酸氨基转移酶、天门冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、肌酐、血清尿素氮等指标均没有统计学差异,说明冬凌草甲素对小鼠的肝、肾和骨髓功能没有明显的毒性。而模型组的网织红细胞相比于空白组升高,提示矽尘对小鼠具有一定的负性效应。监测小鼠的每周体重,发现给药组的体重增长正常,而模型组的体重在造模后的一周减轻,之后逐渐平稳。4、冬凌草甲素下调矽肺小鼠的肺部天然免疫反应。冬凌草甲素给药7天后,对小鼠的肺组织进行蛋白质组学研究。发现模型组和给药组的差异生物学进程主要为异物代谢和单核细胞增殖。进一步对差异蛋白进行功能富集分析,发现冬凌草甲素下调了矽尘所致的天然免疫反应、单核细胞增殖和巨噬细胞源性泡沫细胞分化。在蛋白质相互作用网络中,给药组相比于模型组Stat1和H2-Ab1下调最明显,说明冬凌草甲素主要抑制了矽尘所致的免疫应激和抗原提呈反应。上述结果显示,冬凌草甲素对肺内巨噬细胞的天然免疫反应具有调节作用。5、冬凌草甲素抑制矽尘所致的肺泡巨噬细胞损伤和炎性活化。给予MH-S细胞40μg/cm~2矽尘后,细胞的膜完整性受损、胞酶活力降低、基质暗淡固缩、大量空泡堆积。给予1μM冬凌草甲素后,死细胞相比于模型组减少,细胞维持了原有的活力和形态。与空白组相比,模型组细胞的M1型极化标志物Tnfa、Nos2及促炎标志物Ccl2的基因水平升高（p＜0.05）,而给药组后上述指标均降低,说明冬凌草甲素抑制了MH-S细胞的炎性活化。检测细胞的培养上清液,同样发现模型组IL6、CCL5和CCL11等炎性因子的升高,在冬凌草甲素的介入后大幅下降（p＜0.05）,显示了冬凌草甲素对矽尘干扰的肺泡巨噬细胞的保护作用。6、冬凌草甲素共价结合iNOS蛋白的Thr109位点。生物素化的冬凌草甲素能够与模型组MH-S细胞中的iNOS蛋白直接结合,这与STITCH数据库的网络药理学分析一致。体外实验进一步证明,冬凌草甲素能以浓度依赖的方式与iNOS纯化蛋白发生不可逆的共价结合（p＜0.05）,通过BLI技术测得二者之间的结合力KD值为7.67×10-7M。高分辨LC-MS/MS鉴定了冬凌草甲素共价修饰iNOS的Thr109位点,制备iNOS的T109A突变体,重复该实验后没有发现任何的修饰信号。应用Docking技术对二者的结合进行空间可视化,发现Thr109紧邻负责锚定二聚体的锌指结构域,冬凌草甲素对iNOS的变构活化存在位阻效应。通过Uniprot序列检索和BLAST数据库比对,发现Thr109在iNOS的不同种属中保守,而在e NOS和n NOS亚型中非保守,说明靶向该位点的作用特异性强。7、冬凌草甲素在体外抑制iNOS及下游产物的生成。与空白组相比,矽尘模型组MH-S细胞的iNOS表达增加,而冬凌草甲素抑制了这一异常上调（p＜0.05）,作用效果与iNOS特异性抑制剂1400W相当。模型组iNOS产物NO的荧光相比于空白组增强,而给药后NO的荧光受到抑制。检测细胞内和细胞培养上清液中的氮氧化物,给药组的氮氧化物含量相比于模型组降低（p＜0.05）。向MH-S细胞转染LV-ov-iNOS后,冬凌草甲素减少了iNOS阳性细胞的数量。Western blot和Real-time PCR检测也显示,冬凌草甲素抑制了LV-ov-iNOS细胞中的iNOS水平。8、冬凌草甲素在体内抑制iNOS的表达和酶活性。与矽肺模型组相比,给药组小鼠肺部iNOS的表达和酶活性均降低（p＜0.05）。Western blot检测iNOS上下游通路,显示Stat1和NF-κB p65在给药后降低,而Ubiquitin在给药后升高,说明冬凌草甲素也抑制了上游转录过程和促进了下游降解过程。在Adv-ov-iNOS转染小鼠的肺组织中,冬凌草甲素可使iNOS荧光明显减弱（p＜0.05）。Western blot和Real-time PCR检测也显示,冬凌草甲素抑制了Adv-ov-iNOS小鼠肺部的iNOS水平。结论:1、冬凌草甲素可延缓矽肺小鼠肺炎和肺纤维化的发生发展。2、冬凌草甲素抑制了矽尘所致的肺泡巨噬细胞损伤和炎性活化。3、冬凌草甲素共价结合iNOS靶点,抑制了矽肺中iNOS的表达和酶活性,为矽肺的防治提供了新的思路。