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目的:本研究拟从hippo通路效应因子WWTR1入手,通过生信分析预测其上游调控的miRNA和circRNA,通过分析胃癌患者癌组织及配对正常胃粘膜组织中WWTR1、miRNA和circRNA表达的差异及三者之间的相关性,提出并验证“胃癌中存在circRNA/miRNA/WWTR1调控轴”假设,通过细胞学实验验证轴调控功能,同时分析此轴下游效应因子与胃癌病理生物学行为及患者生存的关联。研究方法:1.通过生信分析选择miR-1258作为WWTR1上游调控miRNA,选择hsa＿circ＿0007482作为miR-1258上游调控circRNA。纳入109例胃癌直接手术患者的新鲜癌组织标本和其配对的正常粘膜组织标本。使用qRT-PCR法检测WWTR1、miR-1258、hsa＿circ＿0007482的m RNA在胃癌组织及匹配正常胃粘膜组织中的表达,使用Western blot法检测WWTR1蛋白在胃癌组织及匹配正常胃粘膜组织中的表达。分析及WWTR1、hsa＿circ＿0007482的m RNA表达与临床病理因素的关联;分析WWTR1与其上游调控的miRNA和circRNA表达的相关性,进而提出基于WWTR1及其上游调控miRNA和circRNA的胃癌发生与进展的轴调控假设。2.选择hsa＿circ＿0007482高表达的胃癌细胞系进行后续细胞功能实验。构建hsa＿circ＿0007482沉默胃癌细胞株。应用CCK8实验、克隆形成实验、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验检测敲减hsa＿circ＿0007482后对细胞生物学功能的影响。应用荧光素酶实验检验hsa＿circ＿0007482和miR-1258、miR-1258和WWTR1是否存在特异性结合位点。qRT-PCR实验检测敲减hsa＿circ＿0007482后对miR-1258和WWTR1表达的影响。应用Western-blot实验检测敲减hsa＿circ＿0007482对WWTR1、TEAD4及EMT信号通路关键蛋白表达的影响。应用Circ Interactome生信预测hsa＿circ＿0007482上游RNA结合蛋白EIF4A3,应用RNA免疫沉淀实验显示EIF4A3对hsa＿circ＿0007482表达的影响。3.收集244例接受直接手术切除且具有常规病理胃癌组织标本的胃癌病例,同时收集配对正常胃粘膜组织225例。使用免疫组化检测并比较WWTR1和TEAD4在胃癌组织和正常胃粘膜组织的表达。分析WWTR1和TEAD4表达和临床病理因素的关联。其中220例患者有随访资料,使用单因素和多因素cox回归分析探索WWTR1和TEAD4与总生存的关联并采用Kaplan-meier方法绘制生存曲线,并根据多因素cox分析结果构建胃癌患者术后死亡的预测模型,使用时间依赖性受试者工作特征曲线评价预测模型预测术后5年生存的能力,计算曲线下面积。根据模型绘制列线图和校准曲线。结果:1.qRT-PCR实验和western blot检测结果显示,与正常胃黏膜组织中的表达相比较,WWTR1的m RNA和WWTR1蛋白在胃癌组织高表达（P＜0.01和0.028）,qRT-PCR实验显示miR-1258在胃癌组织低表（P=0.0456）达,hsa＿circ＿0007482在胃癌组织高表达（P＜0.001）;WWTR1 m RNA和hsa＿circ＿0007482表达与胃癌淋结转移相关（P=0.036和＜0.001）。在胃癌组织中的表达,miR-1258与hsa＿circ＿0007482呈中等负相关（r=0.5841）、与WWTR1 m RNA（r=0.3647）呈弱负相关、hsa＿circ＿0007482与WWTR1呈中等正相关（r=0.4698）,表明hsa＿circ＿0007482可能通过海绵吸附作用与miR-1258结合并下调其表达,促进WWTR1的表达,据此我们提出“胃癌中存在hsa＿circ＿0007482/miR-1258/WWTR1轴调控”的假设。2.选择hsa＿circ＿0007482高表达的BGC823细胞系和MKN45细胞系作为后续细胞功能实验用细胞系。敲减hsa＿circ＿0007482后,CCK8实验显示胃癌细胞增殖能力明显减弱,克隆形成实验显示胃癌细胞克隆形成能力显著减弱,流式细胞术显示细胞周期阻滞于G0/G1期,Transwell实验显示细胞迁移、侵袭能力显著下降。qRT-PCR实验显示敲减hsa＿circ＿0007482后miR-1258表达升高,WWTR1表达下降。Western-blot实验显示敲减hsa＿circ＿0007482后WWTR1、TEAD4蛋白表达降低,E-cadherin表达升高,N-cadherin、Vimentin、Snail表达降低。荧光素酶实验表明hsa＿circ＿0007482和miR-1258、miR-1258和WWTR1存在结合位点。应用Circ Interactome生信预测上游RNA结合蛋白EIF4A3,RNA免疫沉淀实验显示EIF4A3对hsa＿circ＿0007482有富集,qRT-PCR实验显示EIF4A3促进hsa＿circ＿0007482表达。3.免疫组化结果表明,与正常胃粘膜相比,WWTR1和TEAD4在胃癌组织过表达（P均＜0.001）,且WWTR1和TEAD4过表达与淋巴结转移、远位转移、高TNM分期显著相关。单因素生存分析表明WWTR1和TEAD4过表达患者死亡风险显著高于WWTR1和TEAD4低表达患者。TEAD4是总生存的独立影响因素（风险比为1.816,95%CI,1.184-2.786）,并可与M分期一起用于构建死亡风险预测模型。模型预测胃癌患者术后5年死亡风险的ROC曲线下面积AUC为0.727（95%CI,0.664-0.789）。结论:1.胃癌组织WWTR1、hsa＿circ＿0007482高表达,miR-1258低表达,且三者表达存在显著相关性,研究结果支持我们提出的“胃癌中存在hsa＿circ＿0007482/miR-1258/WWTR1轴调控”的假设,即hsa＿circ＿0007482通过海绵吸附miR-1258促进WWTR1表达,进而调控胃癌生物学行为。2.细胞功能学实验验证了hsa＿circ＿0007482/miR-1258/WWTR1轴对胃癌细胞增殖、克隆形成、细胞周期、迁移和侵袭能力的调控作用,且hsa＿circ＿0007482与miR-1258、miR-1258与WWTR1之间存在结合位点。hsa＿circ＿0007482可能通过海绵吸附作用与miR-1258结合并下调miR-1258表达,上调WWTR1表达从而参与诱导胃癌细胞EMT的过程。Hsa＿circ＿0007482上游RNA结合蛋白EIF4A3可与hsa＿circ＿0007482结合并促进其环化与表达。研究证明hsa＿circ＿0007482/miR-1258/WWTR1轴通过调控hippo通路的活性,特异性调控胃癌的生长和进展,此轴调控机制未见既往文献报道,具有较好的理论创新。此轴调控假设的成立为胃癌诊断提供了新的潜在生物标志物,也为胃癌新治疗策略提供了可能的靶点,具有较好的科学价值和临床意义。3.WWTR1和TEAD4过表达与胃癌淋巴结转移、远处转移显著相关,且均是胃癌患者死亡的风险因素。TEAD4与M分期共同构建的胃癌患者术后死亡风险模型具有潜在的预测能力。TEAD4/WWTR1作为反映胃癌预后的生物标志物,其表达水平可辅助临床医生预测胃癌患者预后及制定个体化治疗策略。