【摘 要】
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研究背景:乳腺癌是在全世界妇女中的最常见恶性肿瘤之一。尽管在早期预防、早期诊断和综合个体化治疗方面取得了长足的进步,但由于治疗后复发、远处转移和化疗耐药等临床实践问题,乳腺癌仍然是女性癌症死亡的第一大原因。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）作为调节基因的转录、影响细胞质中的m RNA稳定性、翻译和翻译后修饰的新机制,在癌基因与抑癌基因的调节中发挥不可忽视的作用
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研究背景:乳腺癌是在全世界妇女中的最常见恶性肿瘤之一。尽管在早期预防、早期诊断和综合个体化治疗方面取得了长足的进步,但由于治疗后复发、远处转移和化疗耐药等临床实践问题,乳腺癌仍然是女性癌症死亡的第一大原因。长链非编码RNA（long noncoding RNA,lnc RNA）作为调节基因的转录、影响细胞质中的m RNA稳定性、翻译和翻译后修饰的新机制,在癌基因与抑癌基因的调节中发挥不可忽视的作用,是一种有前途的乳腺癌生物治疗方法,近年来一直是许多人研究关注的对象。尽管有越来越多的研究证据表明lnc RNA与乳腺癌患者的生存期密切有关,但鉴定乳腺癌相关的lnc RNA并阐明其作用机制仍是需要亟待解决的关键问题。Warburg效应作为代谢适应性转变,是肿瘤细胞对抗恶劣的营养环境、维持恶性表型的特征之一,通过增强糖酵解实现快速供能,是导致乳腺癌生存以及患者预后不良的主要机制之一。目前认为HIF-1α通过转录激活HK2、PDK1、LDHA等关键酶的表达,是导致Warburg效应的重要转录因子。从我们前期工作中发现,位于染色体13q12.3上的长非编码RNA LINC00365在乳腺癌患者与乳腺癌MCF-7和HCC-1937细胞中低表达;研究其生物学功能发现,调节LINC00365可激活转录因子NF-κB,从而促进乳腺癌细胞增殖,抑制细胞凋亡。提示LINC00365可能通过影响乳腺癌细胞促生存信号相关转录因子活性,介导抗肿瘤作用。在本研究中,我们通过检测LINC00365对HIF-1α表达的影响,探讨LINC00365是否通过HIF-1α影响乳腺癌细胞糖酵解,通过“逆”Warburg效应抑制乳腺癌细胞生成,为开发基于LINC00365的生物治疗方法提供理论依据。研究目的:通过研究LINC00365在HIF-1α信号中的调控作用,阐明靶向LINC00365抑制Warburg效应影响乳腺癌细胞的存活的机制,为实现乳腺癌的生物治疗提供新思路。实验方法:1.构建pc DNA3.1-LINC00365表达载体,分别转染人乳腺癌HCC-1937细胞和MCF-7细胞中,利用q PCR法检测LINC00365的转录水平。2.转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体,利用MTT法检测过表达LINC00365对MCF-7和HCC-1937细胞生存能力的影响。3.转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体,利用乳酸试剂盒、p H-Xtra检测、ATP试剂盒检测过表达LINC00365对MCF-7细胞和HCC-1937细胞乳酸生成量、胞外酸化率（ECAR）和ATP含量的影响;4.转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体,利用荧光素酶报告基因法检测过表达LINC00365后MCF-7细胞中HIF-1α转录活性变化。5.转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体,利用q PCR和Western blot法检测过表达LINC00365对MCF-7细胞和HCC-1937细胞中HIF-1α、PKM2、HK2和LDHA的转录和蛋白水平的影响。6.建立人乳腺癌裸鼠移植瘤模型,观察过表达LINC00365对乳腺癌细胞体内生长的影响。实验结果:1.分别转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体到HCC-1937细胞和MCF-7细胞中,LINC00365转录水平明显增高。2.与对照组相比,转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体可使HCC-1937细胞和MCF-7细胞生存率明显降低。3.与对照组相比,转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体可使HCC-1937细胞和MCF-7细胞中ATP的生成和乳酸生成均降低。4.与对照组相比,转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体可使HCC-1937细胞和MCF-7细胞HIF-1α转录活性明显下降。5.与对照组相比,转染pc DNA3.1-LINC00365表达载体可使HCC-1937细胞和MCF-7细胞HIF-1α及糖酵解酶HK2、PKM2和LDHA的表达下降。6.与对照组相比,过表达LINC00365明显抑制了MCF-7乳腺癌细胞裸鼠模型中肿瘤的生长（体积和重量）。结论:本研究基于体内外实验发现,LINC00365可通过靶向HIF-1α通路逆转Warburg效应抑制乳腺癌细胞生长,探讨了LINC00365/HIF-1α轴抑制人乳腺癌细胞存活的机制。
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